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.2011年8月；85(16):8172-80.
doi:10.1128/JVI.00435-11。 Epub 2011年6月1日。

水痘-带状疱疹病毒中和抗gH抗体调节gH分布并诱导基因调节，模拟潜伏期

Kimiyasu Shiraki先生 1, 托鲁·大库克, 武本正彦, 吉弘吉田, 铃木一弘, 安史·Akahori, Toshiomi Okuno先生, 黑泽吉贺, 浅野佳三
附属公司

水痘-带状疱疹病毒中和抗gH抗体调节gH分布并诱导基因调节，模拟潜伏期

Kimiyasu Shiraki先生等。 J维罗尔. 2011年8月.

摘要

中和水痘带状疱疹病毒（VZV）的抗糖蛋白H（gH）单克隆抗体（抗gH-MAb）抑制了细胞对细胞的感染，导致单个感染细胞没有凋亡或坏死，用抗gH-MA b处理的培养物中感染细胞的数量在7至10天内下降到检测不到的水平。抗-gH-MAb可将与糖蛋白E（gE）共定位的gH广泛的细胞质分布调节到细胞核附近具有内质网（ER）和高尔基体标记的细胞质隔室，而gE保留其细胞质分布。因此，gH和gE的分解分布导致了细胞感染性的丧失。用抗-gH-MAb治疗4周后，即使在不使用抗-gH-MAb培养8周或其他各种治疗后，感染性病毒也没有恢复。用表达乙型肝炎表面抗原（ROka）的Oka水痘疫苗感染细胞，并用抗gH-MAb治疗4周，通过与母体Oka疫苗的重叠感染从静止感染的细胞中恢复ROka。在基因21、29、62、63和66中，基因63的转录本是检测频率最高的，基因63和62的产物（而非gE）主要在静止感染细胞的细胞质中检测到，而它们在溶血性感染细胞中的核定位则相反。静止感染细胞的转录物和产物的模式与人类神经节中潜伏的VZV相似。因此，抗gH-MAb治疗导致VZV的抗原调节和感染性休眠。抗gH-MAb的抗原调节为VZV感染的发病机制以及VZV在人类神经节潜伏期的基因调控提供了新的视角。

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图1。
图1。
感染中心分析评估的经抗gH-MAb治疗的受感染细胞的感染性随时间变化的丧失。在三个独立的实验中，在每个时间点对6厘米培养皿中的3孔12孔板的斑块数量进行计数并表示为平均值±标准偏差。（A） 抗gH-MAb治疗对感染培养物中感染中心数量的影响。经抗gH-MAb（克隆24）处理或未经处理的培养物中，感染中心的数量分别减少和增加。（B） 用抗gH-MAb（克隆94）治疗的感染细胞的感染性命运。经过处理的细胞的传染性在一周内大大降低，超过2周后没有观察到斑块形成。
图2。
图2。
用免疫荧光法分析经和未经抗gH-MAb治疗的VZV感染细胞中的gB、gE和gH。用亲本Oka菌株接种的HEL细胞未经处理或用抗gH-MAb处理，在感染后第2或第5天固定，并染色。VZV+抗gH-MAb和VZV分别表示VZV感染的细胞带有和不带有抗gH-MA b。图中显示了在低倍（a）和高倍（B）下，感染细胞中含有和不含抗gH-MAb的gB和gE的表达。病毒蛋白和细胞核分别用Alexa Fluor 488（绿色）和DAPI（蓝色）标记。在第2天，gB和gE的表达在未经抗gH-MAb治疗的情况下扩散到邻近细胞，而抗gH-MA治疗在第2和第5天将gB和gE的表达限制在单个细胞内。（C） 用抗gH-MAb（克隆94）处理细胞，从而改变gE和gH的定位。用抗-gE-MAb和Alexa Fluor 488-偶联抗鼠IgG检测gE，感染细胞呈绿色。与Alexa Fluor 594标记的链霉亲和素一起使用表位与克隆94中表位不同的生物素标记的抗gH-MAb（克隆36），感染细胞被染成红色。第2天，gE和gH在感染细胞的细胞质中共定位，没有抗gH-MA b。（e到h）gH和gE在第2天与抗gH-MAb共定位。（a、e、i、m和q）在有抗gH-MAb和无抗gH-MAb的第2天和第5天，gE在细胞质中广泛分布。gH在第2天（f）与抗gH-MAb一起相对集中于细胞核附近的细胞质室，在第5天（j、n和r）主要位于细胞核附近的胞质室，导致gH和gE（h、l、p和t）之间失去共定位。
图3。
图3。
抗gH-MAb治疗诱导的gH细胞室分析。上下面板显示第2天未使用抗-gH-MAb的感染细胞，第5天使用抗-gH-MAb治疗的感染细胞。gH和细胞器标志物BiP/GRP78（ER）、GM130的双重染色(顺式-高尔基）和TGN46（反高尔基）如图所示。将红色染色的抗-gH-MAb（克隆36）与抗BiP/GRP78 MAb、抗GM130 MAb和抗TGN46兔多克隆抗体联合使用。用Alexa Fluor 488-偶联的抗鼠IgG和FITC-标记的抗兔IgG作为二级抗体检测细胞蛋白并染绿。在第2天，gH分布在整个细胞质中，与GM130和TGN46共定位，但与没有抗gH-MAb的Bip/GRP78共定位。第5天，gH、Bip/GRP78、GM130和TGN46与抗gH-MAb在细胞核附近的细胞质室中聚集和共定位。
图4。
图4。
确认通过OkaV重叠感染在静止感染细胞中拯救休眠ROka。对ACV耐药斑块中的HBsAg基因进行432 bp的PCR扩增，证实已救出ROka。用抗gH-MAb处理感染TK缺陷ROka的细胞，并用OkaV感染静止细胞，然后制备无细胞病毒。在10μg/ml阿昔洛韦的存在下分离静止感染ROka细胞产生的斑块，并通过PCR检测是否存在HBsAg基因。当在无阿昔洛韦的情况下分离和繁殖流产斑块时，PCR未检测到HBsAg基因，表明HBsAg基因未被休眠ROka DNA污染。拯救的ROka在阿昔洛韦的存在下生长良好，并拥有HBsAg基因，证实了OkaV的超感染在静止感染细胞中复制了休眠的ROka。
图5。
图5。
病毒蛋白和转录物在静止感染细胞中的表达特征。（A） 静止感染细胞中gB、gE和IE62的免疫荧光染色。用亲本Oka菌株感染的HEL细胞在抗gH-MAb存在下培养4周，然后用IE62（红色）固定和双重染色gB（绿色）或gE（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）标记。（B） IE62和IE63在静止感染细胞中的表达。用IE62（红色）或IE63（绿色）和DAPI（蓝色）（i至t）对模型感染细胞（a至d）、第2天（e至h）未经抗gH-MAb治疗的VZV感染细胞以及经抗gH MAb治疗4周的静止感染细胞进行染色。（a至d）模拟感染的细胞没有用IE62和IE63染色。（e至h）IE62和IE63的核染色和细胞质染色很强，但IE62和IEC 63的分布模式相似，大多在没有抗gH-MAb的VZV感染细胞中共存。（i至l和q至t）成纤维细胞胞浆中观察到抗IE62抗体斑点或点状染色。（m到p和q到t）在细胞浆中观察到抗IE63抗体颗粒染色。（q to t）在圆形细胞的细胞质中观察到IE62和IE63。IE63阳性细胞数量多于IE62阳性细胞，在有限数量的细胞中观察到抗IE62和抗IE63抗体双重染色。（C） 用抗gH-MAb处理的静止感染细胞中的VZV基因组转录物。未经cDNA合成，未从静止感染细胞的提取RNA中扩增PCR产物。基因21、29、62、63和66的转录物如文中所述被扩增，预期的产物大小如图C所示。M表示分子大小为250 bp。（D） 对来自5或6个独立培养物的提取物中的基因21、29、62、63和66的转录物进行了检测，并在图中总结了它们的检测频率。
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