Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing

doi:10.1038/nbt.1857

。2011年5月29日；29(6):542-6.

doi:10.1038/nbt.1857。

通过深度测序对人类细胞中的全局基因进行破坏以将基因分配到表型

Jan E光标¹, 卡拉·普·吉马拉斯, 艾琳·伍特里奇（Irene Wuethrich）, 文森特·布洛曼, 马利尼·瓦拉达拉扬, 孙冲（Chong Sun）, 乔治·贝尔, 冰冰园, 马库斯·穆勒（Markus K Muellner）, 塞巴斯蒂安·M·奈曼, 希德·L·普洛, Thijn R Brummelkamp公司

附属公司

PMID： 21623355
预防性维修识别码：项目经理111863
内政部： 10.1038/nbt.1857

通过深度测序对人类细胞中的全局基因进行破坏以将基因分配到表型

Jan E光标等。 Nat生物技术。 2011。

。2011年5月29日；29(6):542-6.

doi:10.1038/nbt.1857。

作者

Jan E光标¹, 卡拉·普·吉马拉斯, 艾琳·伍思里奇, 文森特·布洛曼, 马利尼·瓦拉达拉扬, 孙冲（Chong Sun）, 乔治·贝尔, 冰冰园, 马库斯·穆勒（Markus K Muellner）, 塞巴斯蒂安·M·奈曼, 希德·L·普洛, Thijn R Brummelkamp公司

附属

¹美国马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所。

PMID： 21623355
预防性维修识别码：下午3111863
内政部： 2018年10月10日至1857年

摘要

单倍体背景中的插入突变可以破坏基因功能。我们通过使用逆转录病毒基因捕捉载体，在除一条染色体外的所有染色体都是单倍体的人类癌症细胞系中，产生98%以上的基因插入，从而扩展了我们早期的工作。我们通过标签测序应用表型询问（PhITSeq），通过选择和平行测序检测数百万突变等位基因。通过分析细胞池而不是单个克隆，可以快速评估与研究表型相关的基因谱。如图所示，这有助于对细胞致死性膨胀毒素（CDT）家族进行比较筛选。CDT是由多种致病性革兰氏阴性菌分泌的毒力因子，对不同解剖部位的组织损伤负责。我们发现743个突变分布在12个人类基因上，这些基因对四种不同CDT的中毒很重要。尽管相关CDT可能共享宿主因子，但它们也利用独特的宿主因子来生成每个CDT的剖面特征。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性金融利益

J.C.和T.R.B.是本手稿中描述的技术专利申请的发明人。S.M.N.和T.R.B.是一家早期创业公司的联合创始人，该公司致力于单倍体遗传方法。

数字

**图1。通过标签测序进行表型询问（PhITSeq）**
A.大约有1亿近单倍体KBM7细胞感染了基因陷阱载体，并且在没有选择的情况下进行了扩增。插入的基因陷阱载体两侧的短DNA序列被平行扩增和测序，并与人类基因组对齐。在KBM7细胞中表达和未表达的基因中确定了插入位点。1亿个细胞的群体用于为特定表型选择数千个克隆。所选克隆被扩展并用于插入位点的平行测序。计算每个插入位点的邻近指数。邻近指数对应于特定插入与其直接上游和下游插入之间平均距离的计算倒数。B.用ABT-737筛选突变细胞，并在所选群体中绘制插入位点。N表示在每个基因中发现的插入数。C.免疫印迹分析BAX和NOXA蛋白在克隆衍生细胞系中的表达，该细胞系包含相应基因中的基因陷阱插入。D.在未选择的诱变池和使用白喉毒素选择的细胞群中HBEGF基因座的插入。与基因（义）处于同一转录方向的基因陷阱插入用绿色表示，反义方向的插入用红色表示。请注意，针对HBEGF功能的选择会导致内含子中义方向插入的富集，而外显子中则不会。

**图2。不同CDT使用的宿主因子**
答：CDT是三部分蛋白毒素，在催化的CdtB亚基中表现出最高的序列保守性，而在细胞结合的CdtA和CdtC亚基中则表现出较低的保守性。使用*H.杜克雷*CTD晶体结构。B.CDT由感染人体并在不同解剖位置定居的病原菌分泌。不同细菌种类的CDT在HeLa细胞和KBM7细胞中诱导G2/M细胞周期阻滞。D.用不同细菌分泌的CDT进行PhITSeq筛选。Y轴表示每次插入计算的接近指数。X轴表示每个插入所在的染色体。N表示在每个基因中发现的插入数。

**图3。与不同表型相关的基因**
A.在CDT中毒关键基因座中确定的基因陷阱插入。颜色代码区分使用不同CDT富集的基因陷阱插入：*A.放线菌*绿色，*大肠杆菌*红色，*H.杜克雷*黄色和*C.空肠*蓝色。B.基因座与12个不同的表型相关。细胞暴露于Bcl2-家族小分子抑制剂（ABT-737）、chk1-激酶活性（AZD7762）、Bcr-Abl-活性（伊马替尼）或DNA甲基化（去甲他滨）。使用生物制剂进行额外的表型选择，包括TRAIL、CDT、白喉毒素、蓖麻毒素和呼肠孤病毒。基因陷阱在外显子序列或基因的义向中的插入按个体选择进行计数。通过比较该数量与未选择细胞群中同一基因座中确定的插入数量，计算每个基因座的富集p值。每一次筛选都会产生1到8个不同的显著性基因。这些包括病原体使用的已知进入因子，如白喉毒素进入受体（HBEGF）、呼肠孤病毒受体（F11R）和蓖麻毒素进入所需的碳水化合物合成酶（MGAT2）。它还包括激酶的下游效应器，例如CDC25A，在带有Chk1抑制剂或PTPN1的筛查中，PTPN1和PTPN12通过使用伊马替尼的BCR-ABL抑制识别。在含有脱氧胞苷激酶（DCK）突变的细胞中观察到了对去甲他滨的强烈耐药性，脱氧胞嘧啶激酶是一种用于激活几种核苷类似物的速率限制激酶。

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[5] Mazurkiewicz P、Tang CM、Boone C、Holden DW。特征标记突变：用于全基因组筛查的条形码突变。《自然评论遗传学》。2006;7:929–939.-公共医学

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[7] Gawronski JD、Wong SMS、Giannoukos G、Ward DV、Akerley BJ。通过深度测序和全基因组筛查肺部所需的嗜血杆菌基因，追踪文库内的插入突变。美国国家科学院院刊。2009;106:16422–16427.-项目管理咨询公司-公共医学

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