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.2011年5月27日；145(5):732-44.
doi:10.1016/j.cell.2011.03.054。

丙酮酸激酶M2是PHD3刺激的低氧诱导因子1辅活化子

罗微 1, 胡红霞, Ryan Chang（瑞安·张）, 钟军（音）, 马修·克纳贝尔, 罗伯特·奥米利, 罗伯特·N·科尔, 阿克希利什·潘迪, 格雷格·塞门扎
附属公司

丙酮酸激酶M2是PHD3刺激的低氧诱导因子1辅活化子

罗微等。 单元格. .

摘要

丙酮酸激酶亚型PKM1和PKM2是PKM2基因的选择性剪接产物。PKM2（而非PKM1）改变癌细胞中的葡萄糖代谢，并通过其已知生化活性无法解释的机制促进肿瘤的发生。我们发现PKM2基因转录被低氧诱导因子1（HIF-1）激活。PKM2直接与HIF-1α亚单位相互作用，通过增强HIF-1与缺氧反应元件的结合和p300募集，促进HIF-1靶基因的反式激活，而PKM1不能调节HIF-1活性。PKM2与脯氨酰羟化酶3（PHD3）的相互作用增强了PKM2结合HIF-1α和PKM2辅活化子功能。质谱和抗羟脯氨酸抗体检测表明PKM2在脯氨酸-403/408上发生羟基化。PHD3敲除抑制PKM2辅活化子功能，减少葡萄糖摄取和乳酸生成，并增加癌细胞中的O（2）消耗。因此，PKM2参与一个正反馈回路，促进HIF-1反式激活，并在癌细胞中重新编程葡萄糖代谢。

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数字

图1
图1。HIF-1调节低氧诱导的PKM1和PKM2表达
（A） 暴露于20%或1%氧气的野生型（WT）和HIF-1α敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）Pkm1、Pkm2和Slc2a1 mRNA的qRT-PCR分析224小时（平均值±SEM，n个= 3–5).***p<0.001与20%O2.###p<0.001与WT MEFs公司。（B） 在暴露于20%或1%O的HeLa细胞制备的核和细胞溶质裂解物中HIF-1α、PKM2、组蛋白H3和α-微管蛋白的免疫印迹分析224小时后，通过密度测定法量化PKM2的强度，并将其归一化为20%O2（平均值±SEM，n个= 3–4).*p<0.05，**p<0.01与20%O2（C）人类内含子1内低氧反应元件的核苷酸序列（HIF-1结合位点5′-ACGTG-3′和5′-CACA-3′以红色显示）PKM2（平方公里）基因。转录起始位点被指定为+1。外显子和内含子没有按比例绘制。（D） 用抗HIF-1α、HIF-2α或IgG抗体从DMOG处理的HeLa细胞（4 h）中沉淀染色质，并通过qPCR（平均值±SEM，n个= 4–5). *p<0.05与IgG。（E和F）HeLa细胞与pGL2p对照（CON）、pGL2p-WT联合转染PKM2（平方公里）HRE（wtHRE）或pGL2p-突变型PKM2（平方公里）HRE（mutHRE）与CGT→AAA（E）或CAC→AAA2在24小时内，FLuc:RLuc活性的比率在20%O下标准化为CON2（平均值±SEM，n个= 4).#p<0.05，###p<0.001与反对的论点；***p<0.001与wtHRE公司。（G） HeLa细胞转染：编码靶向HIF-1α、HIF-2α或打乱对照（SC）的短发夹（sh）RNA的载体；pGL2p-wtHRE；和pSV-Renilla，暴露于20%或1%的O224小时后，FLuc:RLuc活性的比率标准化为20%O时的shSC2（平均值±SEM，n个= 4).***p<0.001与shSC公司。另请参见图S1。
图2
图2。PKM2与HIF-1α相互作用
（A） 使用GST或GST-HIF-1α（531–826）和在含有轻同位素的培养基中生长的HEK293细胞制备的裂解物进行GST下拉分析(12C类6-14N个2-Lys和12C类6-14N个4-Arg）或重同位素(13C类6-15N个2-Lys和13C类6-15N个4-Arg）。通过Q-TOF质谱分析沉淀蛋白（Luo等人，2010）。显示了胰蛋白酶PKM2肽的质谱。与GST-HIF-1α（531–826）结合的PKM2衍生的单同位素峰在其质量/电荷比（m/z）方面大4 Da，并且由于PKM2与GST的非特异性结合，与相应的峰相比具有更高的相对强度。（B） 在暴露于1%O的HeLa细胞中进行Co-IP2用转染PKM2-V5载体的HeLa细胞制备的核裂解物（NL）进行24小时（C）Co-IP，并暴露于1%的O224小时（D和E）用GST或GST融合蛋白进行GST下拉分析，该融合蛋白包含HIF-1α（上面板）和表达PKM2-V5的HeLa细胞的全细胞裂解物（WCL）的指示氨基酸残基。bHLH，基本螺旋-环-螺旋；PAS，Per-ARNT-Sim；TAD，交易激活域；ID，抑制域。
图3
图3。PKM2促进HIF-1激活
（A、B、G和I）HeLa细胞转染p2.1、pSV-Renilla和空载体（EV）或指示表达载体，并暴露于20%或1%的O224小时后，FLuc:RLuc活性的比率在20%O下标准化为EV（A、G和I）或shSC（B）2（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与EV或shSC。（C） 用EV或PKM2-V5（M2）表达载体转染并暴露于20%或1%O的HeLa细胞中HIF-1α、HIF-1β、PKM2-V5和肌动蛋白的免疫印迹分析2用一种编码shSC的逆转录病毒或两种编码不同靶向PKM2（shM2）的shRNAs的逆转录酶病毒转导HeLa细胞4小时，暴露于20%或1%的O24 h后，对WCL进行免疫印迹分析。（E、F和H）HeLa细胞转染GalA或GalO、pG5E1bLuc和pSV-Renilla以及指定的表达载体，并暴露于20%或1%的O224小时后，FLuc:RLuc活性的比率标准化为20%O时的GalO（E和F）或EV（h）2（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与EV或shSC。（J） 使用来自表达FLAG-HIF-1α（531–826）的HeLa细胞的GST、GST-E9或GST-E10和WCL进行GST下拉测定。另请参见图S2。
图4
图4。PKM2的脯氨酸羟基化刺激HIF-1的反激活
（A） 将GST-E10与WCL孵育以诱导羟基化，并通过质谱分析胰蛋白酶肽。断裂谱401LAPITSPTEATAVAVEASFK公司422发现存在羟基化Pro-403或Pro-408的肽。（B） 用WT FLAG-HIF-1α或双突变体（DM）FLAG-HIF1α（P402A/P564A）转染HEK293细胞，并用蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）处理4 h。用抗FLAG抗体进行IP，然后进行免疫印迹分析。通过密度计量化羟基化FLAG-HIF-1α的强度，并将其归一化为WT。（C）HeLa细胞转染编码PKM2-V5或PKM1-V5的载体，并暴露于20%或1%的O2用抗V5琼脂糖进行24 h IP，然后进行免疫印迹分析。（D） HeLa细胞暴露于1%或<0.1%O2用抗PKM2抗体进行IP 4 h，然后进行免疫印迹分析。通过密度计量化羟基化PKM2的强度，并将其归一化为1%O2用编码WT PKM2-V5或PKM2（P403/408A）-V5的载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O2用抗V5琼脂糖进行24 h IP，然后进行免疫印迹分析。（F和G）HeLa细胞联合转染p2.1（F）或GalA（P564A）和pG5E1bLuc（G）；pSV-Renilla；和所示表达载体，并暴露于20%或1%O224小时后，FLuc:RLuc活性的比率标准化为20%O时的EV2（平均值±SEM，n个= 4).***p<0.001与电动汽车；#p<0.05，###p<0.001与PKM2（重量）。（H） 在用编码WT PKM2-V5或PKM2（P403/408A）-V5的载体转染并暴露于1%O的HeLa细胞中进行Co-IP2（I）用PKM2-V5载体转染HeLa细胞，用DMSO或DMOG（100μM）处理4 h。用抗V5琼脂糖进行IP，然后进行免疫印迹分析。（J） 在联合转染FLAG-HIF-1α（DM）和PKM2-V5载体并用DMSO或DMOG处理4 h的HeLa细胞中进行Co-IP。FLuc:RLuc活性的比率标准化为EV+DMSO（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05与电动汽车；#p<0.05，##p<0.01与DMSO。另请参见图S3。
图5
图5。PHD3刺激PKM2的辅激活因子功能
（A） 在与PKM2-V5和PHD3载体共转染的HeLa细胞中进行Co-IP。（B） 使用暴露于1%O的HeLa细胞中纯化的GST、GST-E9或GST-E10和WCL进行GST下拉分析224小时（C）用PKM2-V5载体转染HeLa-shSC、HeLa-sh-PHD3-704和HeLa-sh PHD2细胞，并暴露于20%或1%的O2用抗V5琼脂糖进行24 h IP，然后进行免疫印迹分析。通过密度测定法量化羟基化PKM2-V5，并将其归一化为总免疫沉淀PKM2-V6（平均值±SEM，n个= 3).**p＜0.01，***p<0.001与shSC公司。（D） 用GalA（P564A）载体、pG5E1bLuc、pSV-Renilla和所示表达载体共同转染RCC4细胞24 h。FLuc:RLuc活性的比率归一化为EV（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。多个PHD3、PHD3（H135A/D137A）；mutPKM2、PKM2（P403/408A）。（E） HeLa细胞与GalA（P564A）载体、pG5E1bLuc和pSV-Renilla以及指定的表达载体共同转染，并暴露于20%或1%的O224小时后，FLuc:RLuc活性的比率标准化为20%O时的shSC2（平均值±SEM，n个= 4).***p<0.001与shSC公司。（F） 在与编码双突变（DM）FLAG-HIF-1α（P402A/P564A）、EV或PHD3和PKM2-V5的载体共转染的HeLa细胞中进行Co-IP。（G） 在与编码PKM2-V5和shSC或shPHD3的载体共转染的HeLa细胞中进行Co-IP，并暴露于1%的O2持续24小时。另见图S4。
图6
图6。PKM2增强HIF-1结合和p300对HRE的招募
（A） 用shSC或shPKM2-#1载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O2用IgG、抗HIF-1α或抗HIF-2α抗体（平均值±SEM，n个= 4).#p<0.05与shSC-20%氧化2;*p<0.05与shSC-1%O型2（B）用shSC或shPKM2-#1载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O2用IgG或抗HIF-1β抗体（平均值±SEM，n个= 3).#p<0.05与IgG；*p<0.05与shSC公司。（C和D）HeLa细胞暴露于1%O2用IgG、抗PKM2（C）或抗PHD3（D）抗体（平均值±SEM，n个= 3).**p<0.01，***p<0.001与IgG。（E） 在用PKM2-V5载体转染的HeLa细胞中进行Co-IP 24小时。（F）将表达shSC或shPKM2-#1的HeLa细胞暴露于20%或1%O2用IgG或抗p300抗体（平均值±SEM，n个= 3).*p<0.05，**p<0.01与shSC；###p<0.001与shSC-20%氧化2（G）用shSC或shPKM2-#1载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O2用IgG或抗乙酰化H3K9（H3K9-ac）抗体（平均值±SEM，n个= 3).**p<0.01与shSC公司。（H） 用shSC或shPKM2-#1载体转染HeLa细胞并暴露于1%O2持续24小时。另见图S5。
图7
图7。PKM2和PHD3促进HIF-1依赖性糖酵解代谢
（A） 用shSC或shPKM2-#1载体转染HeLa细胞并暴露于20%或1%的O224小时（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（B） 用shSC或shPKM2-#1和shPKM2-#2逆转录病毒转导HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O2在没有或存在地高辛（100 nM）的情况下持续24 h。通过免疫印迹分析测定指示蛋白的水平，通过密度测定法定量，并归一化为肌动蛋白（平均值±SEM，n个= 4).*p<0.05，***p<0.001。（C） 用shSC或shPHD3-704逆转录病毒转导HeLa细胞并暴露于20%或1%O中的指示mRNA的qRT-PCR分析224小时（平均值±SEM，n个= 3–4).###p<0.001与shSC-20%氧化2;**p<0.01，***p<0.001与shSC-1%O型2用shSC或shPHD3-704逆转录病毒转导（D–F）RCC4细胞。在裂解液中测量葡萄糖，并将其归一化为总细胞蛋白量（平均值±SEM，n个= 3; D） ；在培养基中测量乳酸，并将其归一化为细胞数（平均值±SEM，n个= 3; E） ；O（运行）2测量消耗率（OCR）并将其归一化为细胞数（平均值±SEM，n个= 4–8; F） ●●●●。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.01与shSC公司。（G） PKM2被PHD3羟基化，并与HIF-1α和p300相互作用，从而增强HIF-1和p300对HRE的占用，并增加组蛋白乙酰化。（H） HIF-1活性的前馈机制。HIF-1激活编码PHD3和PKM2的基因的转录，这些基因与HIF-1α相互作用，刺激编码GLUT1、LDHA、PDK1和其他代谢酶的靶基因的反式激活，这些代谢酶介导癌细胞中的Warburg效应。另请参见图S6。
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中的注释

  • PK-M2使HIF1上的细胞变甜。
    坦能达州。 坦能达州。 单元格。2011年5月27日；145(5):647-9. doi:10.1016/j.cell.2011.05.009。 单元格。2011 PMID：21620132
  • 癌症新陈代谢：向前推进。
    塞顿·罗杰斯S。 塞顿·罗杰斯S。 Nat Rev癌症。2011年6月9日；11(7):461. doi:10.1038/nrc3094。 Nat Rev癌症。2011 PMID：21654817 没有可用的摘要。

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