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.2011年5月25日；474(7353):654-7.
doi:10.1038/nature10117。

SAMHD1是树突状细胞和髓细胞特异性HIV-1限制性因子，被Vpx抵消

纳丁·拉盖特 1, 比詹·索比安, 尼科莱塔·卡萨特利, 马修·林格德, 克里斯汀·查布尔·比西亚, 埃曼纽尔·塞格拉尔, 艾哈迈德·亚蒂姆, 圣埃米利亚尼, 奥利维尔·施瓦茨, Benkirane先生
附属公司

SAMHD1是被Vpx抵消的树突状和髓细胞特异性HIV-1限制因子

纳丁·拉盖特等。 自然. .

摘要

灵长类慢病毒辅助蛋白Vpx对抗一种未知的限制性因子，该因子使人类树突状细胞和髓细胞在很大程度上对HIV-1感染不敏感。这里我们将SAMHD1确定为该限制因子。SAMHD1是一种与Aicardi-Goutières综合征有关的蛋白质，Aicardi-Goutièress综合征是一种遗传性脑病，其症状类似于先天性病毒感染，被认为是干扰素反应的负调节因子。我们表明，Vpx诱导SAMHD1的蛋白酶体降解。非许可细胞系中SAMHD1的沉默减轻了HIV-1的限制，并与病毒DNA在感染细胞中的显著积累有关。同时，SAMHD1在敏感细胞中的过度表达可抑制HIV-1感染。SAMHD1的假定磷酸水解酶活性可能是HIV-1限制所必需的。在SAMHD1阴性细胞中，Vpx介导的限制解除被废除。最后，SAMHD1的沉默显著增加了单核细胞衍生树突状细胞对感染的敏感性。我们的结果表明，SAMHD1是一种在髓系细胞中表达的抗逆转录病毒蛋白，可抑制病毒生命周期的早期步骤。

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数字

图1
图1。SAMHD1与Vpx相互作用并被蛋白酶体降解
一、SIVmac251型Vpx从Flag标记和HA-标记的Vpx中进行串联亲和纯化mac251型表达（F/H-Vpx）的THP-1细胞（THP-1-Vpx。洗脱液用SDS-PAGE分离并银染。SAMHD1和之前描述的主要Vpxmac251型用串联质谱法鉴定的相互作用物显示出来（MW，蛋白质分子量标记kDa）。b条通过western blot对DDB1、CUL4A和SAMHD1进行全细胞提取物（WCE）和标记免疫沉淀F/H-Vpx分析。c（c），用50μM MG132处理THP-1细胞2 h，然后用Vpx孵育2 hmac251型含有类病毒颗粒（VLP-Vpx）。与MG132进一步隔夜孵育后，制备全细胞提取物，并用所示抗体进行western blot分析。相对信号强度。d日，通过蛋白质印迹分析SAMHD1在不同细胞类型中的表达谱。e（电子）用双顺反子逆转录病毒载体转导THP-1细胞，表达Vpxmac251型，像素活塞杆，像素RCM-NG公司和VpxRCM-GAB公司以及一个可选择的标记。在细胞分选和全细胞提取后，使用所示抗体通过western blot分析Vpx变体降解THP-1全细胞提取液中SAMHD1的能力。
图2
图2。SAMHD1限制THP-1细胞中HIV-1感染
对THP-1细胞进行工程设计，以稳定表达shRNA 3（3）或shRNA 4（4），特异性靶向SAMHD1（THP-1-shSAMHD1）或打乱shRNA（THP-1-scr）。一用50 ng HIV-LUC-G感染THP-1-shSAMHD1和THP-1-scr细胞。感染24 h后测量荧光素酶活性，并将分析样品中的蛋白质浓度归一化。结果表示为THP-1-shSAMHD1中荧光素酶活性比THP-1-scr细胞增加了一倍。N.I.，未感染。b条在感染50 ng HIV-LUC-G之前，用VLP-Vpx处理THP-1-shSAMHD1和THP-1-scr细胞一结果表示为经VLP-Vpx-处理的细胞中荧光素酶活性比未经处理的细胞增加了一倍。c（c）生成了标记有Flag和HA的SAMHD1（SAMHD1-F/H）突变体，这些突变体要么是shSAMHD1-R抗性的（SAMHD-R），要么是HD域中突变的（SAVHD1（HD/AA））。这些突变体被引入MLV表达载体。星号表示同义突变。d日，用SAMHD1-R转导THP-1-shSAMHD1细胞48小时或不经处理、分化并感染100 ng HIV-LUC-Ga.电子，用SAMHD1-F/H或SAMHD1（HD/AA）转导U937髓系细胞24 H。在进一步的16 H分化步骤后，细胞感染10 ng HIV-LUC-G。如a所示，测量荧光素酶活性。（f）感染HIV-LUC-G或热灭活病毒（56℃）24 h后，通过定量PCR对THP-1-shSAMHD1和THP-1-scr细胞中的总病毒DNA进行定量。结果以最大信号强度的百分比表示。所有图表均显示代表性实验的平均值±标准偏差(n个= 5).
图3
图3。SAMHD1限制原发性MDDC中HIV-1感染
一用VLP-Vpx处理来自健康供体（HD）的THP-1和单核细胞衍生树突状细胞（MDDCs）2 h，并感染100 ng HIV-LUC-G。感染后48 h测量荧光素酶活性，并将蛋白浓度归一化。结果显示，经处理的VLP-Vpx的荧光素酶活性比未经处理的细胞增加了一倍。图表显示了代表性实验的平均值±标准偏差(n个= 4).b条，在使用指定抗体进行western blot分析之前，对a细胞进行全细胞提取。c（c），来自HD1的MDDC被模拟转染或用siRNA靶向转染SAMHD1公司（siRNA 1和2）或dynamin 2（DYN2）48和96小时，然后进行全细胞提取，并使用指示的抗体进行western blot分析。d日在48小时用GFP编码慢病毒载体（LV-GFP，50 ng）转导HD2细胞，4天后用流式细胞仪进行分析。e（电子）、HD2和HD3的转导与d相同，但使用了5 ng的LV-GFP浓度。对来自HD2和HD3的GFP阳性细胞的百分比进行量化，并表示为相对于打乱siRNA处理的细胞，GFP阳性的细胞增加了一倍。（f）来自HD2和HD3的转染MDDC感染10 ng HIV-G。克，来自HD2和HD4的MDDC在感染10 ng荧光素酶表达慢病毒载体（LV-LUC）之前被转染为c。结果如图2a所示。
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