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.2011年6月；121(6):2336-49.
doi:10.1172/JCI46192。 Epub 2011年5月23日。

腺病毒介导的HIF-1α基因转移促进小鼠气道移植微血管修复并减轻慢性排斥反应

新疆 1, 穆罕默德·阿汗, 文田, 约书亚·贝尔克, 拉梅什·纳塔拉扬, 乔恩·科塞克, 默文·C·约德, 格雷格·塞门扎, 马克·R·尼科尔斯
附属公司

腺病毒介导的HIF-1α基因转移促进小鼠气道移植微血管修复并减轻慢性排斥反应

新疆等。 临床研究杂志. 2011年6月.

摘要

慢性排斥反应表现为小气道纤维化（闭塞性细支气管炎[OB]），是肺移植长期存活的主要障碍。最近的研究表明，肺移植所涉及的气道在基线时相对低氧，OB的发病机制可能与气道微血管暂时性丧失引起的缺血有关。在原位气管移植模型中，我们发现HIF-1α介导气道微血管修复。有条件地敲除Hif1a的移植物显示，受体衍生Tie2/血管生成细胞向同种异体移植物的募集减少，受损微血管修复受损，微血管灌注加速丧失，上皮细胞加速剥蚀。相反，通过腺病毒载体诱导的移植物HIF-1α过度表达延长了气道微血管灌注，保持了上皮完整性，延长了移植物免于慢性排斥反应的时间窗口，并减轻了气道纤维化重塑。HIF-1α过度表达可诱导促血管生成因子如Sdf1、Plgf和Vegf的表达，并促进血管修复性Tie2/细胞的招募。本研究表明，在急性排斥反应期间加强血管完整性的治疗可以促进移植物健康并防止慢性排斥反应。

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数字

图1
图1。移植后慢性排斥反应中气管微血管的重塑。
(A类)正常气管。小动脉和小静脉位于软骨环之间和非软骨（解剖上位于后部）膜部分。毛细血管位于软骨部分的上方。(B类)第56天慢性排斥同种异体移植。气管不同部位仅可见毛细血管。软骨部分的血管较少，软骨间和膜部的微血管变得迂曲和紊乱。两个面板都由单独的图像组成。比例尺：100μm。
图2
图2。收件人派生的Tie2+细胞有助于慢性排斥反应中的微血管重塑和通过免疫抑制从急性排斥反应中挽救的供体血管的修复。
(A类)第56天同种异体移植物（Balb/c至FVB[actin-EGFP]）横截面的免疫荧光（IF）染色（图右侧和下图中的上皮下细胞以黑色实线标记）表明，CD31的大部分+细胞（红色）为GFP+（绿色）和收件人来源。(B类)GFP百分比+CD31型+CD31中的细胞+细胞被计算为受体对重塑微血管的贡献百分比(n个= 6). (C类)第28天同种异体移植物（Balb/c至FVB[Tie2-LacZ]）的慢性排斥反应表明+（箭头；绿色）细胞形成管状结构并成为CD31的一部分+（箭头；红色）微血管（顶部面板）。灌注结合IF染色分析显示β-gal+（箭头；红色）细胞由FITC-共轭凝集素灌注（箭头；绿色）（下面板）。(D类)携带急性排斥反应第6天同种异体移植物（Balb/c to FVB[Tie2-LacZ]）的受体小鼠灌流红色印度墨水，然后在X-gal染色后制备完整的气管移植物。收件人派生的Tie2+细胞（蓝色）散在移植物中，主要位于血管外（红色）。(E类)接收方衍生GFP+采用流式细胞术分析第6天同种异体细胞（Balb/c至FVB[Tie2-EGFP]）的CD45和CD31表达。(F类)首先将Balb/c气管移植到B6（具有双重转基因：Tie2-Cre、ROSA26EYFP）小鼠中，然后将第6天的移植物再次移植到受到免疫抑制的WT B6小鼠中；28天后收获再次移植的移植物。移植物组织学正常。IF染色显示一些YFP+单元格（箭头；绿色）成为CD31的一部分+（箭头；红色）脉管系统。比例尺：100μm(A类和D类); 20微米(C类和F类). 数据显示为平均值±SEM。
图3
图3。Hif1a型对于同种异体气管的早期微血管修复至关重要。
(A类)蛋白质印迹Hif1a型和标准df1第2天和第4天气管移植。Actin被用作内部控制。这些车道是在相同的凝胶上行驶的，但不连续。(B类)第3天同种异体骨（Balb/c至B6）的IF染色显示Hif1a型+单元格（箭头；绿色）表示CD31（箭头；红色）。(C类)第6天同种异体移植物的IF染色（Balb/C到FVB[actin-EGFP]）表明，只有一小部分Hif1a型+单元格（箭头；红色）来自收件人（箭头；绿色）。(D类)WT同种异体气管移植的微血管灌注在第10天完全丧失，然后在第21天进行部分血运重建。然而，血管灌注完全丧失Hif1a型CKO气管提前2天（第8天）开始，然后在第21天进行最小程度的血管重建。(E类)计算异体气管灌注面积百分比(n个= 4–6; *P（P）< 0.05). (F类)实时RT-PCR分析第6天WT和Hif1a型CKO同种异体移植(n个= 4; *P（P）< 0.05). (克)第8天WT同种异体移植物的FITC-结合凝集素灌注和IF染色显示正常的微血管灌注（绿色）和假复层柱状上皮（E-cadherin染色；红色）（顶图）。然而，在强烈的拒绝中Hif1a型CKO同种异体移植物，上皮下区域灌注损失，上皮平坦，一些基底膜暴露（下图）。(H（H）)第6天Hif1a型CKO或WT同种异体移植显示Tie2减少+细胞（蓝色）被招募到Hif1a型CKO同种异体移植。(我)第2级+计算每个高功率场的电池数，以确认H（H）(n个= 5; *P（P）< 0.05). 比例尺：20μm(B类,C类、和F类); 100微米(D类和克). 数据显示为平均值±SEM。
图4
图4。HIF-1α基因转移延长了同种异体气道的微血管灌注，缓解了组织缺氧。
(A类)AdLacZ控制腺病毒载体治疗的同种异体移植物在第10天、第12天和第14天失去血管灌注，然后在第21天进行部分血运重建。然而，AdCA5处理的同种异体移植物在第10天和第12天都保持灌注，然后在第14天部分丧失，在第21天几乎完全血运重建。(B类)计算AdLacZ或AdCA5处理的同种异体骨的灌注面积百分比。(n个= 4–6; *P（P）< 0.05). (C类)AdCA5处理的同种异体移植物具有较高的组织pO2与AdLacZ处理的移植物相比的水平。(n个= 4–6; *P（P）<0.05（单个时间点）。(D类)FITC-结合凝集素灌注和层粘连蛋白染色显示，经AdCA5处理的慢性排斥21天同种异体移植物（下表）比经AdLacZ处理的移植物（上表）具有更好的层粘连素投资血管（箭头）。(E类)FITC-结合凝集素灌注和α-SMA染色显示，经AdCA5处理的慢性排斥21天同种异体移植物（下面板）比经AdLacZ处理的移植物（上面板）具有更多的周膜覆盖血管（箭头）。比例尺：100μm(A类); 20微米(D类和E类). 数据显示为平均值±SEM。
图5
图5。HIF-1α基因转移增加血管生成因子的表达，并加速受体衍生细胞对内皮细胞的替代。
(A类和B类)流式细胞术分析第6天同种异体移植物显示浸润的CD4+和CD8+AdLacZ治疗的T淋巴细胞具有可比性(A类)或经AdCA5处理的(B类)样品。百分比表示CD4+或CD8+CD3中的细胞+单核细胞。(C类和D类)第6天同种异体移植的实时RT-PCR分析表明，AdLacZ和AdCA5治疗后促炎细胞因子的表达没有显著差异(C类)，但促血管生成因子的表达Plgf公司,标准df1、和维格夫明显不同(D类) (n个= 6; *P（P）<0.05）。(E类)将AdLacZ或AdCA5处理的Balb/c气管移植到FVB（Tie2-EGFP）小鼠体内，并用流式细胞术分析第6天移植的同种异体气管。AdCA5治疗的同种异体移植物吸收了较高水平的GFP+细胞与AdLacZ处理的移植物的比较(n个= 6, *P（P）< 0.05). (F类)将AdLacZ或AdCA5处理的Balb/C气管移植到FVB（Tie2-LacZ）中，用X-gal染色法对小鼠和12天的同种异体移植进行分析。AdCA5处理的同种异体移植物具有更多受体衍生Tie2+脉管系统（蓝色）。比例尺：20μm。数据显示为平均值±SEM。
图6
图6。HIF-1α基因的过度表达延长了急性排斥异体移植物摆脱慢性排斥反应的时间窗。
(A类)电子显微照片显示用AdLacZ治疗的第10天同种异体移植物中内皮细胞外观异常，基底膜受损，受损血管内有血栓。原始放大倍数，×4500。(B类)电子显微照片显示，经AdCA5处理的第10天同种异体血管内皮细胞外观正常，基底膜相对完整，内皮细胞周围存在周细胞。(C类)在AdLacZ处理的样品中，FITC缀合的凝集素灌注与E-钙粘蛋白的IF染色相结合显示上皮层变平（红色），上皮下微血管灌注缺失（绿色）。经AdCA5处理的样本显示为柱状上皮，上皮下血管灌注。(D类)第12天，用AdLacZ或AdCA5处理的同种异体移植物重新移植到免疫抑制处理的幼稚B6小鼠中，并在重新移植后28天收获同种异体。H&E染色结果显示，AdLacZ治疗的再次移植发生了慢性排斥反应（上图），而AdCA5治疗的再次植入成功逆转了急性排斥反应（下图）。比例尺：20μm。
图7
图7。HIF-1α基因过度表达可减轻气道移植物的纤维化。
(A类–C类)RT-PCR分析第1a1列,第3a1列、和第5a1列mRNA表达显示AdCA5处理的同种异体骨表达水平降低第1a1列(A类),第3a1列(B类)、和第5a1列(C类)第14天和第21天(n个= 6; *P（P）< 0.05). (D类和E类)Picrosius红染色用于评估气管移植中胶原蛋白的水平。AdCA5治疗的第14天胶原沉积减少(D类，右侧面板）和第21天(E类，右侧面板）同种异体移植。比例尺：20μm。数据显示为平均值±SEM。
图8
图8。HIF-1α如何促进气道微血管修复和预防纤维化的模型。
(A类)接收方衍生Tie2方案+在同种异体排斥反应中有助于微血管修复的细胞。排斥反应过程中同种异体移植物缺氧的增加导致内皮细胞中HIF-1α的表达增加，从而进一步诱导促血管生成因子的表达，这些促血管生成因子促进受体来源的血管生成细胞的募集和保留，包括Tie2+单元格（绿色）和其他非Tie2+单元格（黄色）。HIF-1α的增强表达加速血管修复。(B类)HIF-1α基因过度表达对气道灌注和纤维化的影响方案。供体和受体之间的微血管重新连接后，AdLacZ和AdCA5治疗的OTT在移植后第4天恢复灌注。在AdLacZ治疗的同种异体移植物中，进行性微血管损伤导致在第10天左右完全失去灌注，然后在第21天部分微血管重建。重建的微血管在表型上与正常微血管不同。相反，AdCA5治疗的同种异体移植物的微血管灌注延长至第12天。这一解剖发现表明，第12天的同种异体移植物通过免疫抑制“可恢复”到正常结构（对照气道为第8天；蓝线）。在AdCA5处理的气道中，胶原沉积的开始和强度分别显著延迟和减弱（红线）。HIF-1α过度表达的气道纤维化的缓解可能是由于组织缺氧负担减轻（缺血×持续时间），以黄色区域表示。
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