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.2011年8月；54(2):573-85.
doi:10.1002/hep.24427。 Epub 2011年6月26日。

补充性血管和基质调节通路是索拉非尼治疗肝纤维化有益机制的基础

多米尼克·塔布特 1, 奇塔兰詹·劳特雷, 格温·隆伯格, 乌代·谢吉尔, 凯文·格拉泽, 罗伯特·休伯特, 列娜·帕特尔, Tetyana Masyuk公司, 鲍里斯·布莱查兹, 安德鲁·韦尔科克（Andrew Vercnocke）, 埃里克·里特曼, 理查德·埃曼, 劳尔·乌鲁蒂亚, 维杰·沙阿
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补充性血管和基质调节通路是索拉非尼治疗肝纤维化有益机制的基础

多米尼克·塔布特等。 肝病学. 2011年8月.

摘要

肝星状细胞（HSC）和肝内皮细胞（LECs）之间的旁分泌信号调节纤维化、血管生成和门脉高压。然而，调节这些过程的机制尚未完全确定。索拉非尼是一种受体酪氨酸激酶抑制剂，可阻断肿瘤细胞中的生长因子信号传导，但对肝非实质细胞（包括HSC和LECs）也显示出重要且尚未完全表征的作用。本研究的目的是验证索拉非尼影响HSC和LEC之间的旁分泌信号，从而调节与慢性肝损伤相关的基质和血管变化的假设。补充磁共振弹性成像、显微计算机断层扫描和组织化学分析表明，索拉非尼可以减弱大鼠胆管结扎诱导的肝损伤引起的基质和血管室的变化。细胞生物学研究表明，索拉非尼显著减少了细胞间的并置和连接复合体，从而减少了这些正弦屏障细胞之间通常观察到的邻近性。在分子水平上，索拉非尼下调HSC释放的血管生成素-1和纤维连接蛋白，二者均依赖于转录因子Kruppel-like因子6，这表明该途径是慢性肝病相关基质和血管变化的基础。

结论：总之，本研究结果表明索拉非尼抑制慢性肝病伴随的基质重组和血管重塑，并表征了这种作用的细胞和分子机制。这些数据可能有助于完善以大量纤维化和新生血管为特征的晚期胃肠道和肝脏疾病的未来治疗方法。

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数字

图1
图1
索拉非尼减轻损伤引起的肝硬度/基质沉积增加体内.A&B:SHAM和BDL手术大鼠经载体或索拉非尼治疗后，在4周时接受MRE，并评估肝硬度的变化。与SHAM大鼠相比，载体BDL大鼠的肝脏硬度显著增加。在接受索拉非尼治疗的BDL大鼠中，这种变化显著减弱（N>4，平均值±SEM，*p<0.05，sham-vehicle，**BDL-vehicle）。定量分析用图形A表示；代表性动物的图像显示在B中（上面板：MRI图像，下面板：带有刚性彩色热图的MRE图像）。C&D：索拉非尼或载体治疗的SHAM和BDL大鼠的天狼星红染色；与给药大鼠相比，索拉非尼减轻了BDL大鼠的基质沉积（10X；N>4，平均±SEM，*p<0.05，sham-vehicle，**BDL-vehicle）。定量分析用C表示，代表性图像用D表示。
图2
图2
索拉非尼减轻损伤诱导的肝血管重塑体内试验。A&B:SHAM和BDL大鼠经载体或索拉非尼治疗后，进行肝脏vWF免疫荧光检测。分析表明，与BDL-vehicle相比，BDL-sorafenib大鼠的新毛细血管形成减弱（20X，n>3，平均值±SEM，*p<0.05，BDL-vehicle）。定量分析如A所示；具有代表性的图像如B.C&D所示：用载体或索拉非尼治疗的SHAM和BDL大鼠被注射Microfil®; 扫描特定的肝叶以测量血管体积（左中上面板；D）。图像也进行了数字重建，以量化血管分支（右上面板；D）。血管体积/肝脏比率和分支数量的定量分析用C表示；代表性动物的图像显示在D.BDL大鼠的下面板上，通过血管体积/肝脏体积比和更高的分支数目测量，经载体证实，肝总血管空间增加。索拉非尼在BDL大鼠中与总血管间隙显著减少（n>4，平均±SEM，*p=0.01，BDL-vehicle）和一级/二级/三级分支减少（*p<0.05，BDL-vehicle）相关。
图3
图3
索拉非尼抑制内皮细胞-星状细胞相互作用和通讯在体外答：人HSC和LEC分别用DS-Red或YFP标记，并在Matrigel中共培养。HSC之间形成血管网(红色)或LEC(绿色)当HSC在与LEC共培养之前用索拉非尼预处理时，这一现象被显著抑制，这可以通过减少LEC和HSC的并列来证明。（左：索拉非尼组或对照组的代表性图像；上面板为10X，下面板为Z-stack放大，100X。右：LEC之间、HSC之间以及两种细胞类型之间并列的血管连接的复合数据（n=3，平均值±SEM，*p<0.05对照）。B： 人LEC和HSC在Matrigel中与用对照载体或索拉非尼预处理的HSC共培养的TEM（上面板：10000X，下面板：50000X）；实心箭头表示对照车辆观察到的两种细胞类型之间的紧密并列，但在索拉非尼处理的细胞中被破坏，如虚线箭头所示。C： ZO-1染色（红色）显示TSEC之间的连接。ZO-1在用基础培养基处理的TSEC中显示适度染色，而用来自于车用HSC处理的条件培养基（CM）的质膜染色是稳健的；当用索拉非尼处理的HSC衍生的CM处理时，ZO-1染色显著降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-基础，**p<0.05-CM）。上部表示具有代表性的图像。下部，在复合图中描述数据。D： 用载体或索拉非尼处理的HSC的CM在Matrigel上孵育的人LEC的TEM（上部，10000X，下部，50000X）；左面板中的箭头表示当用来自车用HSC的CM处理时，连接复合体和LEC的紧密并置。虚线箭头表示当CM来自HSC并用索拉非尼预处理时，LEC之间的连接中断。
图4
图4
索拉非尼抑制HSC中血管生成素-1（Ang1）和纤维连接蛋白的释放。A： HSC用索拉非尼（2μmol/l）处理1h，用PDGF刺激10分钟，然后裂解为Western blot。索拉非尼抑制PDGFRβ和下游分子Akt和Raf-1的磷酸化，以及HSC中纤维连接蛋白的合成。使用siRNA降低HSC中Raf-1的敲除效果。Raf-1沉默HSC中纤维结合蛋白的合成减少。描述了具有代表性的斑点。B： PDGF后HSC中q-PCR合成Ang1的时间进程。Ang1 mRNA水平在PDGF后24小时呈暂时性增加，达到最大值（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-basal）。C： 索拉非尼和伊马替尼抑制PDGF诱导的HSC Ang1合成。（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-车辆，**PDGF）。D： 当用PI3-K抑制剂沃特曼（wortmannin）而不是MEK抑制剂U012处理HSC时，PDGF刺激后Ang1 mRNA水平降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.05-vehicle）。E： 用Raf-1 siRNA转染细胞，用/不用PDGF处理，并在转染后48小时裂解。PDGF处理后Raf-1沉默HSC中Ang1 mRNA的PCR结果显示，与打乱的siRNA/PDGF相比，没有显著变化（n=3，平均值±SEM，相对于打乱的PDGF）。
图5
图5
KLF6介导PDGF诱导的血管生成素-1（Ang1）合成。A： PDGF刺激HSC后KLF6 mRNA水平升高。与单独使用PDGF相比，使用索拉非尼刺激PDGF 24小时后KLF6 mRNA水平降低（n=3，平均值±SEM，*p<0.005-对照，**对照-PDGF）。B： 当使用siRNA敲低KLF6时，PDGF对Ang1 mRNA水平的刺激被消除（n=3，平均值±SEM，*p<0.005-craft，**craft-PDGF）。C： 没错，KLF6沉默的HSC中纤维连接蛋白水平降低。左图显示了siRNA对KLF6的有效敲除。D：在缺乏KLF6 siRNA的情况下，来自KLF6沉默、PDGF刺激HSC的CM中的LEC小管生成与来自PDGF模拟HSC的CC相比显著降低（*craft-PDGF）。E： ChIP分析评估KLF6与Ang1启动子的结合。E描述了与对照组相比，血管紧张素-1与过度表达的标记KLF6的PDGF结合增加。
图6
图6
HSC释放血管生成素-1（Ang1）促进LEC形成连接的能力在体外答：如图3C所示，对TSEC进行ZO-1染色，以评估LEC对CM的反应与分子之间的连接。用HSC条件培养基培养LEC的对照组中，ZO-1染色显著增加。当用索拉非尼b处理的HSC衍生的CM处理LEC时，ZO-1染色增加被消除。索拉非尼的抑制作用通过向CM中添加人重组（rh）-Ang1而部分逆转（ZO-1染色增加4倍）。当LEC在含有Ang1中和抗体的HSC CM中孵育时，ZO-1染色的抑制也以类似于索拉非尼的方式观察到（n=3，平均值±SEM，*p＜0.05-基底培养基，**CM，***CM）。B： 人LEC在Matrigel上培养，其中HSC衍生CM用载体或索拉非尼处理或添加Ang1中和抗体处理，并制备样品用于TEM。与CM孵育的LEC显示出紧密的并置和连接复合物，与含有rh-Ang1的CM和索拉非尼的细胞孵育时也显示出这种复合物（之前在图3D中描述了含有索拉非尼布组的CM）。向CM中添加Ang1中和抗体导致LEC-LEC并置出现缺口和破坏，如箭头所示（上面板：10000X，下面板：50000X；箭头指向LEC-LEC接触部位）。
图7
图7
HSC释放血管生成素-1促进LEC小管生成和迁移；A： HSC释放血管生成素-1促进LEC小管生成；与IgG对照组相比，当细胞在PDGF刺激的HSC衍生CM中孵育并添加Ang1中和抗体时，Matrigel上人LEC的管形成减少（*p<0.05-CM，**CM-PDGF）。B： 当细胞与来源于用索拉非尼预处理的HSC的CM孵育时，Matrigel上人LEC的管形成减少（*p<0.05-CM）。在培养基中添加rh-Ang1，部分缓解了索拉非尼的抑制作用。C： 根据CM的趋化反应和所述的干预措施，评估人类LEC的迁移。用索拉非尼b处理的HSC衍生的CM刺激时，LEC迁移减少；向培养基中添加rh-Ang1可逆转这种效应（*p<0.05碱性培养基，**CM）。与Ang1中和抗体处理的CM孵育时，LEC迁移减少（***p<0.05-CM）。
图8
图8
示意图描述了1）PDGF调节HSC中Ang1和纤维连接蛋白生成的信号通路，2）通路分别对血管和基质变化的影响，以及3）索拉非尼如何抑制这些通路。
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