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.2011年6月1日；71(11):4040-7.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-4563。 Epub 2011年4月21日。

解耦联癌症突变揭示了肉瘤中p53缺失的关键时间

内森·P·杨 1, 丹尼斯·克劳利, 泰勒·杰克
附属公司

解耦联癌症突变揭示了肉瘤中p53缺失的关键时间

内森·P·杨等。 癌症研究. .

摘要

众所周知，癌症是随着多种变化的相继累积而发展的，但事件的时间顺序如何影响肿瘤的发生和/或进展仍基本未知。在这里，我们描述了一种小鼠模型，该模型允许暂时不同的癌症突变。通过将Flp诱导的K-ras等位基因（G12D）与Cre介导的p53缺失的既定方法相结合，我们能够在体内外分别控制这些常见相关癌症基因的突变。我们发现，在软组织肉瘤小鼠模型中，延迟与K-ras（G12D）激活相关的p53缺失可以减少肿瘤负担，表明p53强烈抑制肌肉中非常早期的转化步骤。此外，利用体内RNA干扰，我们暗示p53靶基因p21在这一过程中是一个关键的介质，强调细胞周期阻滞是一种极为有效的肿瘤抑制机制。

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数字

图1
图1。结构和初始特征K-ras公司FSF-G12D型
答：。目标战略示意图K-ras公司FSF-G12D型，包括（i）内源性的K-ras基因基因座，（ii）目标载体，（三）目标正确K-ras公司FSF-G12D型轨迹，以及（iv）重组的K-ras公司Frt-G12D型Flp表达式之后。绿色方框=外显子；粗黑条=Southern blot探针；star=致癌点突变G12D；B=巴米希；K=千磅/平方英寸。B。非靶向的Southern印迹(K-ras公司+/+)并正确定位(K-ras公司FSF-G12D型/+)BamHI/KpnI双消化和用外部5′探针杂交后的ES细胞克隆。C、。的特征K-ras公司FSF-G12D型/+MEF公司。顶部面板：从K-ras公司FSF-G12D型/+感染表达Cre（Lenti-Cre）或Flpe（Lenti-Flpe）慢病毒的MEF。底部面板：Western blot ofK-ras公司+/+和K-ras公司FSF-G12D型/+MEF未感染或感染Lenti-Flpe。D。肺叶苏木精和伊红（H&E）染色的代表性切片K-ras公司FSF-G12D型/+Ad-Flpo感染后16周的小鼠。比例尺为500μm。
图2
图2。MEF中K-ras和p53的序列突变
答：。初始移植实验的结果，表示为引入不同MEF系和不同治疗条件（玉米油或三苯氧胺）后出现肿瘤的注射部位数量体内; 4欧姆在体外). 实验细节见正文。B。重组分析第53页弗洛克斯在注射到动物体内之前，在所产生的FKCP MEF肿瘤或亲代MEF中的等位基因。C、。K-ras和p53的顺序突变示意图。详见正文。D。向nu/nu小鼠注射subQ细胞后0周（A组红方）、1周（B组蓝三角）或3周（C组黄X）p53缺失的肿瘤的生长动力学和总发病率。对小鼠进行23周的监测。
图3
图3。延迟与K-ras相关的p53缺失G12D系列激活可减少软组织肉瘤小鼠模型的肿瘤形成
答：。序贯突变策略的实验大纲，显示复合突变小鼠的基因型和治疗方案。详见正文。B。显示三苯氧胺治疗在Ad-Flpo感染后第0天（黑色条）、第10天（红色条）或第21天（绿色条）开始的小鼠肿瘤发病率的条形图。C、。点图显示通过p53缺失（三苯氧胺治疗）后肿瘤形成时间测量的肉瘤动力学。颜色方案与中的相同（b）学生T检验用于统计显著性.D。PCR分析K-ras公司和第53页基因座。
图4
图4。K-ras中p53反应的特征G12D系列-表达肌肉细胞
答：。已确诊肉瘤的代表性GFP IHC(i、。)和肌肉切片(ii、。和（三）。)肌肉内Ad-Cre感染K-ras公司LSL-G12D型/+;阿尔夫绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白动物进行了8周的试验(i、。)或6天(ii、。和（三）。)Ad-Cre感染后。箭头在ii、。指向染色较深的细胞，在高倍镜下显示三.比例尺=100μm。B。Kaplan-Meier图显示一组患者无肉瘤生存率K-ras公司LSL-G12D型/+; 碎布2−/−; 阿尔夫绿色荧光蛋白/绿色荧光蛋白（红线和黑线）或阿尔夫GFP公司/+（黄线和绿线）感染慢病毒的小鼠，慢病毒表达Cre和靶向荧光素酶（黑色和绿色线）或p21（红色和黄色线）的shRNA。C、。p21或p19基因敲除引起的肉瘤的蛋白质印迹阿尔夫/第16页墨水4a在里面K-ras基因LSL-G12D型/+; 阿尔夫GFP公司/+; 抹布2−/−动物。D。肌肉组织上的GFP IHCK-ras公司LSL-G12D型/+（或K-ras公司+/+); 第53页弗洛克斯/+; 抹布2−/−感染Cre-GFP慢病毒后（p.i.）指定时间的动物。GFP染色为棕色，用于标记注射部位的印度墨水染色为黑色。两种细胞中都存在大量感染细胞K-ras公司+/+和K-ras公司LSL-G12D型/+这表明对癌基因表达细胞没有明显的清除作用。比例尺=100μm。
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