Roles of microRNA-29a in the antifibrotic effect of farnesoid X receptor in hepatic stellate cells

doi:10.1124/mol.110.068247

.2011年7月；80(1):191-200.

doi:10.1124/mol.110.068247。 Epub 2011年4月21日。

microRNA-29a在肝星状细胞法尼体X受体抗纤维化作用中的作用

姜丽¹, 张一飞, 拉马林加·库鲁巴, 向高, Chandrashekhar R甘地, 文燮, 宋丽

附属公司

PMID： 21511916
预防性维修识别码： PMC3127536型
内政部： 10.1124/月.110.068247

microRNA-29a在肝星状细胞法尼体X受体抗纤维化作用中的作用

姜丽等。分子药理学. 2011年7月.

.2011年7月；80(1):191-200.

doi:10.1124/mol.110.068247。 Epub 2011年4月21日。

作者

姜丽¹, 张一飞, 拉马林加·库鲁巴, 向高, Chandrashekhar R甘地, 文燮, 宋丽

附属

¹美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261。

PMID： 21511916
预防性维修识别码： PMC3127536型
内政部： 10.1124/月.110.068247

勘误表in

摩尔药理学。2012年8月；82(2):360

摘要

肝纤维化是一种慢性疾病，其特征是纤维生成和纤溶之间的平衡发生改变，导致过量的细胞外基质（ECM）积聚和正常肝脏结构的扭曲。静止的肝星状细胞（HSC）激活并转化为肌纤维母细胞样细胞是肝脏ECM生成增加的主要机制。核受体法尼体X受体（FXR）在HSC中显示出强大的抗纤维化活性，并在鼠肝纤维化模型中保护动物。然而，详细的机制仍不完全清楚。在本研究中，我们报告了使用合成FXR配体3-[2-[2-氯-4-[[3-（2,6-二氯苯基）-5-（1-甲基乙基）-4-异恶唑基]甲氧基]苯基]乙烯基]苯甲酸（GW4064）治疗导致野生型小鼠、大鼠和人类分离的HSC中microRNA-29a（miR-29a）上调，但FXR（-/-）小鼠未上调。miR-29a似乎在ECM生成的调节中起抑制作用，原因如下：1）用miR-29a-模拟物转染HSC导致编码ECM蛋白的几个基因的mRNA表达急剧下调；和2）miR-29a显著抑制含有相应ECM基因3'非翻译区的报告表达质粒的表达。我们的结果表明，miR-29a是一个FXR靶基因，因为通过药物或基因激活FXR，miR-29启动子活性显著增加。人类miR-29a启动子的功能分析确定了一个由一个核苷酸DNA基序隔开的不完全反向重复序列，即反向重复-1（5'-AGGTCAcAGACCT-3’），作为一个可能参与miR-29a调控的FXR反应元件。我们的研究揭示了FXR负调控HSC中ECM表达的新机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
GW4064治疗导致大鼠HSC ECM基因mRNA表达下调。大鼠HSC的分离如下所述*材料和方法*培养7天以允许反式激活。然后用GW4064（1μM）或DMSO载体处理HSC。治疗24小时后，通过实时RT-PCR测定几个ECM基因的mRNA表达水平。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与DMSO相比）。

**图2。**
GW4064治疗导致HSC中miR-29a表达上调。用GW4064或DMSO载体处理大鼠HSC（A）或LX2细胞（B）。治疗24小时后通过实时RT-PCR检测miR-29a的表达水平。GW4064对miR-29a表达的影响在从野生型小鼠（C）或*外汇储备*（−/−）小鼠（D）。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与DMSO相比）。

**图3。**
miR-29a的过度表达导致大鼠HSC中ECM基因的mRNA表达下调。用miR-29a模拟物、非特异性对照miRNA模拟物或miR-29a-抑制剂（6孔板中25 pmol/孔，10μl脂质体）转染HSC 24 h。然后通过实时RT-PCR测定几个ECM基因的mRNA表达水平。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与对照miRNA相比）。

**图4。**
miR-29a通过靶向其mRNA的3′-UTR调节ECM基因的表达。在miR-29a模拟物或非特异性对照miRNA模拟物存在的情况下，用荧光素酶构建物转染CV-1细胞，其中含有Col1A1-3′-UTR（a）、Col3A1-3′-UTR（B）或ELN-3′-UTR-（C）。在转染后24小时进行萤光素酶测定。面板中显示的数据表示三次分析的平均值（S.D.）。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与对照miRNA相比）。

**图5。**
FXR增强miR-29a基因启动子的转录活性。利用1984个碱基对的人类miR-29a启动子驱动的荧光素酶报告子来研究miR-29a启动子的活性。在存在或不存在pCMX-FXR的情况下，用pGL3-miR-29a瞬时转染CV-1细胞。5小时后，将转染培养基替换为完整培养基，培养细胞20小时。然后在GW4064或载体DMSO存在下培养细胞24小时。然后进行荧光素酶分析。面板中显示的数据表示三次分析的平均值（S.D.）。为了检测FXR的遗传激活对miR-29a启动子活性的影响，在存在或不存在pCMX vpFXR的情况下，用pGL3-miR-29a转染CV-1细胞。然后按照上述方法检查荧光素酶分析。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与DMSO相比）。

**图6。**
人类miR-29a启动子中推测FXRE的分析。A、利用基于网络的算法（NUBIScan）进行电子分析，识别人类miR-29a启动子中的假定FXRE。B、 miR-29a/IR-1介导异源tk-luciferase报告基因的FXR反式激活。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与DMSO相比）。C、 miR-29a启动子上miR-29a/IR-1的突变消除了FXR的激活。n个= 3; *,*P（P）*<0.05（与DMSO相比）。D、人miR-29a启动子中FXR/RXR与miR-29a/IR-1结合的电泳迁移率变化分析。双标记寡核苷酸（−1924/−1936）最终标记为[γ-³²P] ATP使用T4多核苷酸激酶。将标记探针与体外翻译的RXR/FXR孵育20分钟。反应通过在非变性5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后进行放射自显影分析。在一些研究中，样品在凝胶电泳前用抗FXR抗体预先孵育。E、 LX-2细胞中人类miR-29a启动子中FXR与miR-29a/IR-1结合的ChIP分析。用1μM GW4064或DMSO处理LX2细胞24小时，制备可溶性染色质。染色质用针对FXR的抗体免疫沉淀。提取的DNA使用覆盖miRNA-29a启动子IR-1一致序列的引物对进行PCR扩增。

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