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.2011年4月8日；8(4):399-411.
doi:10.1016/j.stem.2011.02.006。

靶向HIF1α消除血液系统恶性肿瘤中的癌干细胞

王殷（音） 1, 刘燕（Yan Liu）, 萨米·马利克, 潘正, 杨柳
附属公司

靶向HIF1α消除血液恶性肿瘤中的癌干细胞

王殷（音）等。 细胞干细胞. .

摘要

肿瘤干细胞（CSC）的分子靶向性对于有效治疗癌症具有潜在的治疗潜力，尽管迄今为止确定的特定靶点相对较少。低氧诱导因子（HIF）最近被证明可以调节低氧条件下胶质瘤干细胞的致瘤能力。令人惊讶的是，我们发现，在常氧条件下，HIF1α信号在小鼠淋巴瘤和人类急性髓细胞白血病（AML）的干细胞中被选择性激活。HIF1a shRNA和HIF抑制剂抑制小鼠淋巴瘤和人类AML CSC的集落形成单位（cfu）活性。重要的是，HIF抑制剂棘霉素通过优先消除CSC，有效地消除了小鼠淋巴瘤和异种模型中可连续移植的人类AML。Hif1α通过抑制Notch通路中的负反馈回路来维持小鼠淋巴瘤CSC。总之，我们的结果证明了Hif1α-Notch相互作用在维持CSC中的重要作用，并为靶向CSC治疗血液恶性肿瘤提供了有效途径。

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数字

图1
图1
通过HIF抑制剂选择性地消除淋巴瘤CSC。a.用棘霉素选择性消融淋巴瘤CFU。在CFU检测之前，将培养的淋巴瘤细胞在培养基中用一定剂量的药物治疗24小时。所示数据为三倍的平均值+/-SD，并已由3个独立实验证实。b.c-Kit中的组成型HIF活性+细胞及其对棘霉素的敏感性。上图和中图中的FACS图谱显示了GFP报告基因的特异性，通过表达GFP的细胞和c-Kit在野生型HRE中的共表达，而不是突变型HRE慢病毒报告基因。底部面板显示了棘霉素抑制的剂量反应。转染HRE报告系统的淋巴瘤细胞在不同浓度的棘霉素存在下培养12小时，c-Kit的%+GFP公司+与未治疗组相比，细胞正常化（1.13%，定义为100%）。导致c-Kit减少50%的剂量+GFP公司+单元格定义为IC50。补充数据图S3a中给出了报告人及其特异性的详细描述。c.HIF抑制剂对淋巴瘤CSC CFU的选择性优于来自造血祖细胞（HPC）的CFU。c-套件+Sca-1型+在CFU检测之前，将TGB或正常骨髓细胞用给定浓度的棘霉素处理过夜。显示的数据是未经治疗的对照组的%，是三倍的平均值+/-S.D。d.ShRNA沉默降低CFU活性对棘霉素的敏感性。淋巴瘤细胞用打乱载体或Hif1a型ShRNA载体并测试其对棘霉素抑制的反应。注意，ShRNA组产生的CFU活性数量大大减少。为了更好地进行比较，未接受棘霉素治疗组的CFU活性定义为100%。在shRNA组中，100%定义为每200000个细胞88（sh1）和132（Sh2）CFU。在对照组中，100%=448 CFU每200000个细胞。e.棘霉素选择性诱导CSC凋亡。培养的淋巴瘤细胞在培养基中用20 pM棘霉素或载体处理16小时。处理后的细胞用c-Kit和Sca-1染色，然后用Annexin V.f染色。培养淋巴瘤细胞（1X106/小鼠）腹腔注射到免疫活性B10.BR小鼠体内。14天后，每隔两天注射10μg/Kg/支棘霉素，共5次。对照组小鼠只接受载具。每天观察小鼠存活情况。所示数据代表了2-3个独立实验。CSC的特征见图S1和S2，体外繁殖和自发淋巴瘤HIF活性和HIF活性的报告者见图S3。
图2
图2
组成活性HIF1α对CSC的维护至关重要。a和b.基因表达。用BD-FACSAria分选系统将培养的淋巴瘤细胞分选成c-Kit+Sca-1型+或c-Kit-Sca-1型−分数。The transcripts ofHIF1a、HIF2a、HIF3a、Vhl、Glut1和控制基因β肌动蛋白通过RT-PCR测定。a.RT-PCR产品照片。b.实时PCR测定的相对表达。的相对表达式Hif1a型,葡萄糖转运蛋白1和cMyc公司FACS分类c-Kit中的转录本+Sca-1型+来自TGB肿瘤（脾脏肿瘤）或骨髓（BM）的细胞。表达水平表示为家政基因片段，β肌动蛋白.c.在c-Kit中选择性积累Hif1α蛋白+但不是c-Kit−通过Western blot检测TGB肿瘤细胞。c-Kit软件+（纯度83%）和c-Kit−用MAC微球纯化（纯度99%）亚群并进行Western blot分析。d.沉默Hif1a型废除c-Kit+Sca-1型+施工监理顾问。TGB肿瘤细胞感染带有干扰shRNA的慢病毒载体或表达两个独立shRNA（sh-1或sh-2）的慢病毒质粒。感染后第三天，用流式细胞仪对肿瘤细胞进行分析。GFP你好和GFP洛对细胞进行门控并分析c-Kit和Sca-1的表达。e、。Hif1a型shRNA减少CFU。培养的淋巴瘤细胞感染了慢病毒Hif1a型shRNA或棘球打乱的shRNA，用5μg/ml速效杀菌素筛选感染细胞一周。将感染细胞接种到1%的甲基纤维素培养基中，密度为2X105/好吧。在显微镜下计算菌落数。所示数据为三倍菌落数的平均值+/-SD，代表三个独立实验。f.人类对shRNA诱导缺陷的补充HIF1A型cDNA。用慢病毒载体控制或编码人HIF1α蛋白的载体转导TGB肿瘤细胞。在选择急速杀菌素后，用慢病毒载体转导细胞，该慢病毒载体可传递打乱的shRNA或Hif1a shRNA-1与人类不匹配HIF1A型根据EGFP的表达对转导细胞产生的CFU进行计数。g。HIF1a型shRNAs消除肿瘤起始活性。TGB肿瘤细胞被表达扰乱的ShRNA或HIF1αShRNA的慢病毒感染3次，然后注射到B10.BR小鼠（9X105/小鼠腹腔注射）。通过Kaplan-Meier分析比较受体小鼠（n=5）的存活率。尸检证实，所有死亡的小鼠都患有淋巴瘤。此图中显示的所有数据已重复至少两次。慢病毒转导效率见图S5。
图3
图3
下调沃尔基因对CSC的维持至关重要。a.下调沃尔c-Kit中的转录本+Sca-1型+细胞。TGB胸腺瘤细胞被分类为c-Kit+Sca-1型+和c-Kit−Sca-1型−子集，如图S1所示沃尔实时PCR检测转录物。b.异位表达沃尔消融CSC。TGB肿瘤细胞感染慢病毒载体控制或表达慢病毒载体沃尔cDNA。感染后第三天，用流式细胞仪对肿瘤细胞进行分析。GFP你好和GFP洛对细胞进行门控并分析c-Kit和Sca-1的表达。c。沃尔表达降低肿瘤CFU。培养的淋巴瘤细胞感染了慢病毒沃尔cDNA或载体，感染细胞用5μg/ml的短梗霉素筛选一周。将转导的细胞以2X10的密度接种到1%的甲基纤维素培养基中5/好吧。在显微镜下计算菌落数。所示数据为一式三份的菌落数平均值+/-SD，代表三个独立实验。d.异位表达沃尔cDNA抑制肿瘤起始活性。TGB肿瘤细胞被慢病毒表达载体单独感染3次或沃尔cDNA，然后注射到B10.BR小鼠（9X105/小鼠腹腔注射）。通过Kaplan-Meier分析比较受体小鼠（n=5）的存活率。尸检证实淋巴瘤的发展。这个实验重复了两次。
图4
图4
HIF与Notch通路协同工作，以维持CSC。a.通过Notch抑制剂L685458抑制肿瘤CFU。将培养的淋巴瘤细胞用给定剂量的L685、458处理24小时，并进行CFU分析。所示数据为三份样品的平均值+/-SD，代表至少3个独立实验的数据。b.增强CSC中的Notch活动，如以下级别所示赫斯1抄本。将患有TGB肿瘤的脾脏淋巴瘤细胞分类为c-Kit+Sca-1型+或c-Kit-Sca-1型−分数。的表达式赫斯1实时PCR检测这两个组分的mRNA。c.抑制槽口3种不同HIF抑制剂的活性。根据制造商的方案（Militenyi Biotec），用APC结合的抗c-Kit抗体对培养的TGB淋巴瘤细胞进行染色，并使用抗APC涂层的MACS珠富集两次。c-kit阳性细胞富集样品（60.4%c-kit+细胞）用HIF抑制剂处理16小时。提取处理细胞的mRNA进行PCR。所示数据是三倍的平均值+/-SD，代表至少3个独立实验的数据。2ME2，2-甲氧基雌二醇；GA，格尔德霉素。d.ShRNA沉默Hif1a型简化表达式赫斯1TGB肿瘤细胞转导Hif1a型shRNA。用杀鼠灵筛选转导的细胞，并对其进行分析Hif1a，谷氨酸1和赫斯1实时PCR的转录本。e–小时。Notch I-C dRdA的异位表达揭示了Notch在CSC维持中的关键作用1-42d操作。e.截短的Notch基因，在抑制Notch靶基因表达方面具有强大的显性负活性赫斯1左上角显示Notch蛋白细胞内部分的示意图，标记了RAM的位置、7个锚蛋白重复序列（ANK1-7）、转录激活域（TAD）、C末端OPA（O）和PEST（P）序列。左下方的面板显示了dRdA的组成1-4dOP突变体缺乏RAM、ANK1-4和C端O、P序列，但插入了核定位序列（NLS）。右侧面板显示对赫斯表达式。通过载体控制或dRdA连续三次转导后1-4dOP突变体，分离RNA和赫斯用定量PCR测定。所示数据为三倍平均值，并通过两个独立实验进行了复制。f.dRdA1-4国防部废除了c-Kit+Sca-1型+子集。TGB肿瘤细胞感染慢病毒载体控制或表达dRdA的慢病毒载体1-4《行动计划》。感染后第三天，用流式细胞仪对肿瘤细胞进行分析。GFP你好和GFP洛对细胞进行门控并分析c-Kit和Sca-1的表达。g.缺口IC-dRdA1-42dOP降低在体外CSC的自我更新活动。培养的淋巴瘤细胞感染了编码dRdA的慢病毒载体1-4dOP或通过连续三次自旋聚焦控制病媒。所示数据是三份平板中菌落数的平均值+/-SD，并且代表了至少三个独立实验的结果。h.dRdA1-4dOP消除肿瘤起始活性。TGB肿瘤细胞被慢病毒表达载体单独dRdA感染3次1-4dOP，然后注射到B10.BR小鼠（1X106/小鼠腹腔注射）。通过Kaplan-Meier分析比较受体小鼠的存活率，并通过log-rank检验确定统计显著性。所有死亡的小鼠都患上了淋巴瘤。这个实验重复了两次。CSC中Notch1和2的表达见图S6。
图5
图5
HIF1α抑制负反馈调节赫斯1通过防止赫斯1绑定到中的N个框赫斯1发起人。a.图赫斯1发起人。详细顺序见图S6b。b.HIF1α不与Notch直接协同激活Hes1启动子。这个赫斯1启动子序列（−225至+65，TSS as+1）与GFP连接，并与载体对照或包含编码HIF1α（P402，564>A，称为HIF1α-PA）、Notch-IC cDNA或Notch-IC+HIF1αPA的cDNA的载体一起转染293细胞。启动子活性通过转染细胞的绿色荧光强度来测量。显示的数据是相对强度。Hes1-GFP报告者的强度定义为1.0。联合转染的Renilla lucifese使转染效率标准化。c.HIF1α部分抑制Hes1介导的赫斯1发起人。如b所示，除了赫斯1或突变型HIF1a型使用cDNA。d.HIF1α减少Notch信号中Hes1表达的负性自我调节。与b中一样，除了使用了不同的cDNA组合。的活动赫斯1报告者在没有转染Hes的情况下，HIF1α-PA和Notch被定义为1.0。e.HIF1αPA和Hes1之间的竞争抑制赫斯启动子，如ChIP所示。将编码Flag或Myc标记的Hes1和HIF1αPA的cDNA转染到293细胞中。转染后36小时，对转染物进行ChIP分析。当编码Hes1和HIF1αPA的cDNA单独或联合转染时，各组细胞的等分细胞用于Western blot，以确认蛋白质表达水平基本相同（数据未显示）。目前的数据是输入DNA百分比的平均值+/-S.D.（n=3），如使用图S6b中标记的引物通过实时PCR进行测量。所示数据为三份数据的平均值+/-S.D。这些实验已经重复了至少三次。在启动子检测用的24孔板或CHIP检测用的6孔板中进行转染。用于转染的总DNA量为0.5μg/孔板（24孔板）和1.5μg/孔板（6孔板）。启动子序列见图S6bHes1、，标记有HRE、N-box和引物序列。
图6
图6
HIF1α是在异种小鼠模型中治疗性消除人类AML的靶点。a.分离AML样本中的4个肿瘤细胞亚群。对AML患者MI-AML-71的骨髓细胞进行CD34和CD38染色，并将其分为4个亚群进行RNA分离。左面板显示了预排序样本和用于排序的门，中面板和右面板显示了后排序种群。面板中提供了每个闸门中单元的百分比。b.表达HIF1a型（顶部）和GLUT1公司在子集中。显示的数据是基因转录水平的平均值+/-S.D.，表示为来自相同样本的β肌动蛋白的%。CD34表达增强+CD38型−所有6份AML样本均观察到样本。c.CD34中HIF1α蛋白的积累增加+CD38型−AML细胞。CD38型+用抗CD38结合磁珠进行阴性选择，使细胞耗尽。剩下的细胞进一步分离成CD38−CD34型+（纯度72-78%）和CD38−CD34型−阳性选择（纯度96-100%）细胞，两个群体的裂解产物用于Western blot。d.HIF1α活性对AML-CFU至关重要。AML-60和AML-71被打乱（Sr）或HIF1a型shRNA（Sh-2）。根据EGFP信号计数转导AML细胞的CFU。在电镀之前通过FACS测量转导功效。GFP的百分比+用于实验的细胞为：AML60:Sr，32.6；第2:32.48页。AML-71:Sr:45.70；第2:40.19页。使用的shRNA，Sh-2，靶点在小鼠和人类之间共享序列HIF1a型基因。数据显示为每2x10 CFU5细胞。e、。HIF1a型沉默增加了CFU对棘霉素的耐药性。与e中一样，除了转基因细胞外，其他细胞均用给定浓度的棘霉素处理。数据显示，正常化至未治疗组的CFU百分比（定义为100%）。对照组的菌落数如图6d所示。d和e中的数据重复了一次，得出了相同的结论。f.所有7份AML样本中的AML-CFU对棘霉素高度敏感。AML样本（2.5x105/用2ml培养基中给定浓度的棘霉素预处理外周血（PB）或骨髓（BM）24小时。然后将处理过的活细胞在105/用于CFU分析，一式三份。7–10天后计算菌落数。显示的数据是未经处理对照的%平均值+/-S.D。g.棘霉素选择性地消除CD34+CD38型−AML细胞的子集。将原始AML样品从液氮中解冻。在隔夜恢复后，在含有10%胎牛血清和由CSF、GM-CSF和IL-3组成的人细胞因子混合物的RPMI 1640中，用给定剂量的棘霉素或载体对照培养30小时，浓度为5X105/毫升。用抗CD34、CD38抗体结合Annexin V和DAPI对细胞进行染色。所示数据为Annexin V的百分比+DAPI公司+/−具有指定标记的单元格。附件五+减去载体处理组的细胞百分比。填充符号显示CD34的数据+CD38型−子集，而开放符号显示了大量白血病细胞（CD34）的数据+CD38型+适用于AML9、AML32、AML60、AML71和CD34−CD38型+对于AML15、AML36和AML132）。这些数据重复了两次。h.人类AML对NOD-SCID小鼠的治疗作用，数据显示为人类CD45（hCD45）的%+最后一次治疗后40天，受体小鼠骨髓中的细胞。治疗效果已重复两次。i.Echinomycin在体内不诱导AML细胞的分化，如治疗组和未治疗组的大部分人类细胞缺乏成熟的髓系标志物所揭示的那样。数据显示了CD45中CD14和CD15的分布+细胞。j.选择性耗尽CD34+CD38型−以棘霉素为亚组。顶部面板中显示的数据是CD34的丰度+CD38型−小鼠骨髓中的亚群，而下部面板显示的是人类白血病细胞内的亚群。k.尽管存在白血病细胞，但来自棘球绦虫素治疗小鼠的骨髓未能在新的NOD-SCID小鼠中重新激发白血病。代表性概况显示在顶部面板中，而每组5只小鼠的汇总数据显示在下部面板中。异基因模型中AML细胞的表型见图S7。
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