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.2011年3月28日；6（3）：e18271。
doi:10.1371/journal.pone.0018271。

ROCK抑制剂Y-27632抑制分离诱导的小鼠前列腺干/祖细胞凋亡并提高其克隆效率

李章 1, 约瑟夫·巴尔德斯, 张伯玉, 雷伟, 蒋畅, 李欣
附属公司

ROCK抑制剂Y-27632抑制分离诱导的小鼠前列腺干/祖细胞凋亡并提高其克隆效率

李章等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

RhoA/ROCK信号通路的激活已被证明有助于解离诱导胚胎和神经干细胞的凋亡。我们之前证明，约有1/40的Lin（-）Sca-1（+）CD49f（high）（LSC）前列腺基底上皮细胞具有干细胞自我更新和多系分化的能力。我们在这里显示，在体外前列腺集落分析中，用ROCK激酶抑制剂Y-27632处理LSC细胞可将其克隆效率提高8倍。Y-27632治疗可以使前列腺集落细胞有效地进行复制，而这在其他情况下是不会发生的。Y-27632还提高了前列腺球试验和游离前列腺细胞再生试验中前列腺干细胞的克隆效率。克隆效率的提高是由于抑制了分离诱导的RhoA/ROCK激活介导的前列腺干细胞凋亡。前列腺上皮细胞与细胞外基质分离会增加PTEN活性并减弱AKT活性。Y-27632单独处理足以抑制细胞分离诱导的PTEN活性激活。然而，这并没有提高克隆效率，因为Y-27632处理会在相同程度上增加野生型和Pten阴性前列腺细胞的球形形成单位。最后，敲除这两种ROCK激酶的表达会略微提高前列腺集落细胞的重新种植效率，这证实了它们在Y-27632介导的克隆效率提高中发挥了主要作用。我们的研究表明，根据目前采用的分析，具有干/祖细胞活性的前列腺细胞的数量可能被低估，支持分离诱导的凋亡是具有上皮表型的胚胎干细胞和体细胞的共同特征，并强调了环境线索对干细胞维持的重要性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Y-27632治疗可提高体外前列腺集落分析中前列腺干细胞的克隆效率。
（A） 对生长在12孔板中的前列腺菌落进行台盼蓝染色，该板涂有胶原蛋白、基质凝胶和丝裂霉素处理过的Swiss3T3饲养层（含或不含Y-27632）。（B） 柱状图比较了克隆活动*P<0.05，**P<0.0005。
图2
图2。Y-27632治疗增加LSC的前列腺集落形成活性（Lin−Sca-1型+CD49f型高的)基底细胞8倍。将来自dsRED小鼠的FACS分选的LSC细胞以每孔133至2667个细胞的稀释系列，在有和没有Y-27632的情况下，接种在线粒体蛋白酶处理的Swiss3T3层细胞上。
图表显示了每种稀释度下生长的菌落数量与输入细胞数量的关系。斜面代表了群居单位。
图3
图3。Y-27632治疗使前列腺集落细胞具有再生能力。
用胰蛋白酶分离原代前列腺集落细胞，并将其涂布在胶原蛋白涂层的12孔板上，稀释范围为每孔1000至4000个细胞，含或不含Y-27632。（A） 在没有和存在Y-27632的情况下对继发前列腺集落进行台盼蓝染色。（B） 图表显示了每种稀释度下生长的菌落数量与输入细胞数量的关系。斜坡代表群落形成单位。
图4
图4。Y-27632治疗可提高前列腺球试验和前列腺再生试验中前列腺干细胞的克隆效率。
（A） 条形图显示了带有和不带有Y-27632的初级和次级前列腺球形培养物的球形形成单位。误差条表示3口井的平均值和标准差*P（P）<0.005, **P（P）<0.05. （B） 图像显示在前列腺再生之前用Y-27632和不用Y-27632处理的游离前列腺细胞再生的前列腺组织。白色条=2 mm，黑色条=100µm。条形图显示再生组织的重量。误差条表示4个移植物的平均值和STD*P（P）<0.005.
图5
图5。Y-27632治疗抑制前列腺上皮细胞分离诱导的凋亡。
（A） Western blot分析比较经与未经Y-27632治疗的游离前列腺上皮细胞中ROCK1、ROCK2、MYPT、pMYPT和裂解caspase 3的表达。（B） 用碘化丙啶（PI）和Annexin V进行FACS分析，测量用和不用Y-27632处理的游离前列腺上皮细胞中凋亡细胞的百分比。条形图量化了早期和晚期凋亡细胞的百分比。误差条表示两个独立实验的平均值和STD*P（P）<0.005. （C） 条形图比较了使用和不使用10µM Y-27632处理的分离前列腺上皮细胞的DNA断裂程度。误差条表示两个独立实验之一的三倍的平均值和STD*P（P）<0.001。
图6
图6。虽然Y-27632抑制了解离诱导的PTEN激活，但它并没有促进Y-27633诱导的前列腺干/祖细胞克隆效率的提高。
（A） Western blot分析在含有和不含10µM Y-27632的前列腺集落细胞中生长的蛋白质表达，以及在悬浮培养4小时的游离原代前列腺集落上皮细胞中，含有和不含有10µM-27632。（B） 条形图显示了Y-27632存在和不存在时WT和PTEN KO前列腺细胞的球形单位。误差条表示3口井的平均值和标准差*P（P）<0.05, **P（P）<0.005.
图7
图7。同时下调ROCK1和ROCK2表达可提高前列腺集落细胞的克隆效率。
（A） 条形图比较了在含有或不含Y-27632的12孔胶原蛋白涂层板中生长的WT和ROCK1 KO前列腺集落的克隆形成活性*P（P）<0.005, **P（P）<0.05. （B） 用靶向ROCK2的siRNA或混乱的siRNA处理的ROCK1无效前列腺集落细胞中ROCK2表达的Western印迹分析。（C）条形图比较了混乱的siRNA-和ROCK2 siRNA处理的ROCK1无效前列腺集落细胞的复制效率*P（P）<0.001.
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参考文献

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