Bromodomain protein 7 interacts with PRMT5 and PRC2, and is involved in transcriptional repression of their target genes

doi:10.1093/nar/gkr170

.2011年7月；39(13):5424-38.

doi:10.1093/nar/gkr170。 Epub 2011年3月29日。

溴化酶蛋白7与PRMT5和PRC2相互作用，并参与其靶基因的转录抑制

苏基尔·泰伊¹, 弗拉杰什·卡克哈尼斯, 凯文·贝拉斯科, 玛丽亚娜·亚妮娃, Hediye Erdjument-Bromage公司, 保罗·坦普斯特, 萨伊德·西夫

附属公司

PMID： 21447565
预防性维修识别码： PMC3141267型
内政部： 10.1093/nar/gkr170

溴化酶蛋白7与PRMT5和PRC2相互作用，并参与其靶基因的转录抑制

苏基尔·泰伊等。核酸研究. 2011年7月.

.2011年7月；39(13):5424-38.

doi:10.1093/nar/gkr170。 Epub 2011年3月29日。

作者

Sookil Tae公司¹, 弗拉杰什·卡克哈尼斯, 凯文·维拉斯科, 玛丽亚娜·亚妮娃, 赫迪耶遗迹群, 保罗·坦普斯特, 萨伊德·西夫

附属

¹俄亥俄州立大学医学院分子和细胞生物化学系，俄亥俄州哥伦布，俄亥俄州，俄亥俄州43210，美国。

PMID： 21447565
预防性维修识别码： PMC3141267型
内政部： 10.1093/nar/gkr170

摘要

组蛋白修饰调节基因表达，这一过程中的一个主要调节步骤是识别表观遗传标记的蛋白质招募指定转录结果所需酶的能力。这里我们证明BRD7是hSWI-SNF复合物的一个成分，与PRMT5和PRC2相互作用。招募研究表明，BRD7与PRMT5和PRC2在患者源性B细胞系中的“肿瘤发生抑制因子7”（ST7）和视网膜母细胞瘤样蛋白2（RBL2）启动子上共定位，其与这些靶基因的关联与H3R8、H4R3和H3K27的超甲基化有关。此外，抑制BRD7表达可减少PRMT5和PRC2向ST7和RBL2启动子的募集；然而，只有ST7在转录上被解除表达。对PRMT5-和PRC2诱导的表观遗传标记的评估表明，虽然H3（Me（2））R8、H4（Me）R3和H3（Met（3））K27标记从ST7启动子中删除，但RBL2启动子组蛋白的去甲基化不完全。我们还发现精氨酸脱甲基酶（RDM）JMJD6可以消除PRMT5诱导的H4R3甲基化，H3K27赖氨酸特异性脱甲基酶KDM6A/UTX和KDM6B/JMJD3可以不同地被招募到ST7和RBL2。这些发现强调了BRD7在PRMT5和PRC2诱导的转录沉默中的作用，并表明需要招募特定的RDM和KDM才能有效地抑制转录。

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数字

**图1。**
BRD7与含有PRMT5的hSWI/SNF复合物共同纯化。(A类)使用M2抗凝琼脂糖珠，通过亲和层析纯化来自对照（Ctrl）HeLa S3（1和2道）或HeLa 53/Fl-BAF45细胞（3和4道）的核提取物，并通过银染色分析5µl的空隙率和峰率。(B类)使用所示抗体对15µl亲和纯化对照HeLa S3（第2道）和标记的hSWI/SNF复合物（第3道）进行蛋白质印迹分析。输入通道显示了20µg HeLa S3/Fl-hSWI-SNF核提取物中hSWI–SNF亚单位的表达。(C类)使用免疫前（PI）（第2道）或免疫抗CBP抗体（第3道）免疫沉淀HeLa S3/Fl-BAF45细胞的核提取物（250µg），并使用指示的抗体进行western blot分析。输入表示20µg HeLa S3/Fl-BAF45核提取物。(D类)将来自对照HeLa S3或HeLaS3/His-BRD7细胞的RIPA提取物与Ni–NTA琼脂糖珠孵育，并在广泛洗涤～15µl亲和纯化对照HeLa S3（第2道）或His-BRD 7组分（第3道）后，按照（B）中所述进行蛋白质印迹分析。输入显示20µg HeLa S3 RIPA提取物中BRD7-相关蛋白的水平。(E类)HeLa S3/His-BRD7 RIPA提取物用PI（第2道）或抗CBP抗体（第3道）进行免疫沉淀，并使用所示抗体通过western blotting检测蛋白质。(F类)大约250µg HeLa S3 RIPA提取物用PI（第2道）和免疫抗BRD7抗体（第3道）免疫沉淀，并通过western blot分析检测BRD7相关蛋白。

**图2。**
BRD7可以直接与hSWI/SNF和PRC2组件交互。(A类和B类)等量（1–2µg）的GST、GST-PAH2或GST-BRD7固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，并与³⁵S标记的hSWI–SNF和PRC2亚单位。大量洗涤后，通过放射自显影术检测残留蛋白。输入通道代表在每个反应中使用的蛋白质总量的10%。(C类)添加之前，类似数量的GST、GST-PAH2或GST-EED与谷胱甘肽琼脂糖珠结合³⁵S标记的PRC2亚单位和BRD7。按照A中所述对样品进行处理和检测。

**图3。**
PRMT5、SUZ12和BRD7在ST7和*RBL2型*发起人。(A类)RIPA从普通CD中提取¹⁹⁺使用所示抗体通过免疫印迹法分析B细胞或转化的JeKo MCL和WaC3CD5 B-CLL细胞系。抗β-肌动蛋白用于显示等负荷。(B类)使用对照PI、抗PRMT5、抗SUZ12或抗BRD7抗体对来自正常B细胞或转化的JeKo和WaC3CD5细胞的交叉链接染色质进行免疫沉淀，并使用ST7特异性引物集和探针通过实时PCR分析免疫沉淀DNA（扩增子1：从-102到+6）（B），*RBL2型*（放大器1：从-85到-16）(C类)和控制ST5（放大器1：从-118到-59）(D类). (**E–G公司**)使用PI或免疫抗体进行ChIP分析，这些抗体可以特异识别PRMT5诱导的甲基化标记H3（Me₂)R8和H4（Me₂)R3或PRC2诱导的H3（Me_三)K27，实时PCR检测ST7，*RBL2型*和ST5启动子序列，如（B–D）所述。浓缩度按投入的百分比计量。ChIP实验进行了两次，PCR反应进行了三次。

**图4。**
PRMT5、PRC2和BRD7共存于ST7和*RBL2型*. (A类–C类)使用来自JeKo或WaC3CD5细胞的交联和MNase处理的染色质进行ChIP分析，在核蛋白复合物首次与所示抗体免疫沉淀（第一抗体）后，在20 mM DTT存在下释放它们。接下来，使用PI、抗PRMT5或抗SUZ12抗体进行第二轮免疫沉淀（第二抗体），并按照图3所示进行实时PCR。该实验分两次进行，共三次。

**图5。**
BRD7敲除触发ST7的转录去表达，但不是*RBL2型*. (A类)使用来自对照或BRD7敲除细胞系的1µg总RNA，通过RT-PCR测量BRD7 mRNA的水平。18 S水平被用作内部控制。(B类)使用抗BRD7、抗ST7、-*RBL2型*抗ST5或抗β-肌动蛋白抗体。(**C–E类**)ST7等级，*RBL2型*如图5A所示，通过实时RT-PCR测定ST5 mRNA。图表显示了每个基因相对于对照WaC3CD5细胞的表达的归一化变化，使用*18秒*作为内部控制。

**图6。**
招募PRMT5和PRC2到ST7和*RBL2型*BRD7敲除细胞中的启动子减少。(A类)使用抗PRMT5、抗SUZ12或抗β-ACTIN的western blotting分析来自对照或BRD7敲除细胞的全细胞提取物（40µg）。为了检测PRMT5和PRC2诱导的表观遗传标记，使用抗H3（Me₂)R8，抗H3（Me_三)K27或抗H4（Me₂)R3抗体。抗H3和抗H4均用于显示相等的负载。用对照PI、抗PRMT5、抗SUZ12或抗BRD7抗体免疫沉淀来自对照WaC3CD5和BRD7敲除细胞的染色质，并用RT-PCR分析纯化的DNA以确定ST7的富集(B类),*RBL2型*(C类)和ST5(D类)启动子序列。(**E–G公司**)精氨酸和赖氨酸甲基化标记在ST7降低，但没有*RBL2型*BRD7敲除细胞中的启动子。使用PI、抗H3（Me）进行ChIP分析₂)R8，抗H4（Me₂)R3或抗H3（Me_三)检测K27抗体和靶启动子序列，如图3所示。每个图中的数据点显示了两个独立实验的平均值。

**图7。**
精氨酸和赖氨酸特异性去甲基酶在ST7和*RBL2型*发起人。(A类)PRMT7不参与*RBL2型*在WaC3CD5细胞中。使用PI或抗PRMT7抗体以及GAS1、GAS2和*RBL2型*使用基因特异性引物集和探针通过实时PCR检测启动子序列。该实验重复两次，实时PCR重复三次。使用PI、抗JMJD6、抗JMJP3或抗UTX抗体对来自对照WaC3CD5和BRD7敲除细胞的交联染色质进行ChIP分析。通过实时PCR扩增免疫沉淀DNA，以确定ST7处每个脱甲基酶的富集(B类),*RBL2型*(C类)和ST5(D类)发起人。（E）使用指示的抗体通过蛋白质印迹分析来自对照WaC3CD5和WaC3CD5/BRD7敲低细胞的RIPA提取物（40µg）。抗β-肌动蛋白用于显示等负荷。

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