Essential role of MeCP2 in the regulation of myofibroblast differentiation during pulmonary fibrosis

doi:10.1016/j.ajpath.2011.01.002

.2011年4月；178(4):1500-8.

doi:10.1016/j.ajpath.2011.01.002。

MeCP2在肺纤维化过程中肌成纤维细胞分化调控中的重要作用

彪虎¹, Mehrnaz Gharaee-Kermani公司, 吴哲, Sem H Phan公司

附属公司

PMID： 21435439
预防性维修识别码：项目经理3078459
内政部： 10.1016/j.ajpath.2011.01.002

MeCP2在肺纤维化过程中肌成纤维细胞分化调控中的重要作用

彪虎等。美国病理学杂志. 2011年4月.

.2011年4月；178(4):1500-8.

doi:10.1016/j.ajpath.2011.01.002。

作者

彪虎¹, Mehrnaz Gharaee-Kermani公司, 吴哲, Sem H Phan公司

附属

¹密歇根大学医学院病理学系，美国密歇根州安阿伯48109-2200。

PMID： 21435439
预防性维修识别码：项目经理3078459
内政部： 10.1016/j.ajpath.2011.01.002

摘要

DNA甲基化是抑制基因表达，包括成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）基因表达的关键机制。然而，与甲基化α-SMA基因相互作用以调节其表达的反作用因子尚未确定。通过凝胶位移和染色质免疫沉淀（ChIP）分析，甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）与α-SMA基因结合。由MeCP2基因敲除小鼠分离的肺成纤维细胞中，siRNA抑制MeCP2的基因表达或其缺陷导致α-SMA基因表达显著降低。相反，将MeCP2表达质粒瞬时转染成纤维细胞可增强α-SMA基因的表达。此外，体内研究表明，与野生型同窝小鼠相比，MeCP2缺陷小鼠在气管内注射博来霉素后，肺泡壁厚度、炎症细胞浸润、间质胶原沉积和肌成纤维细胞分化显著降低。因此，MeCP2对肌成纤维细胞分化和肺纤维化至关重要。

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数字

图1
MeCP2与α-SMA基因的结合。答：合成了跨越α-SMA基因启动子区CpG岛、内含子1位点1和内含子1站点2的甲基化和非甲基化寡核苷酸引物，并用³²P用于电泳迁移率变化分析。在与指示剂量的MeCP2孵育后，通过凝胶电泳对样品进行分析。如有指示，向反应混合物中添加100倍多余的冷探针。特定的DNA蛋白复合物由**实心箭头**.B类：按照指示处理细胞，然后使用ChIP分析和抗MeCP2抗体分析MeCP2与α-SMA基因启动子的结合。在与抗体（“MeC”）或对照IgG（“IgG”）孵育后，沉淀的DNA以及未分离的DNA（输入或“Inp”）通过PCR使用跨越α-SMA基因启动子区。然后在1.3%琼脂糖凝胶中分离PCR产物。

图2
MeCP2对α-SMA表达的影响。用MeCP2表达载体（“MeCP2”）或对照空载体（“Vector”）转染肺成纤维细胞(A类和C类)，或MeCP2（“MeCP2”）或随机对照（“对照”）siRNA(B类和D类). 然后仅用缓冲液（“缓冲液”）或TGFβ（4 ng/mL）处理细胞。然后用GAPDH作为负荷控制，通过western blotting分析α-SMA蛋白(A类和B类). 显示了具有代表性的斑点(**上部面板**在里面A类和B类)，然后对来自三个独立实验的印迹进行扫描、数字量化，并将其表示为归一化到各自GAPDH带后的倍数变化(**下部面板**,A类和B类).C类和**医生：**从小鼠肺成纤维细胞中提取总RNA，并将其转染为A类和B类然后以18S rRNA为参照物，以缓冲液处理对照物为校准物，通过实时PCR分析α-SMA mRNA水平，计算2^-ΔΔCT所有条形图显示平均值±SE，其中N个= 3. 的统计显著差异**P（P）*与相应载体或siRNA控制值相比，<0.05。在所有显示的实验中，TGFβ治疗的效果具有统计学意义（即TGFβ处理组与相应的缓冲对照组）。

图3
DNA甲基化和MeCP2对α-SMA启动子活性的影响。甲基化或非甲基化α-SMA基因启动子构建物α-SMApro-intron-Luc与MeCP2表达质粒（“MeCP2”）或对照载体（“vector”）共同转染到大鼠肺成纤维细胞中，转染48小时后分析荧光素酶活性。荧光素酶活性标准化为其各自的Renilla荧光素酶控制活性，结果表示为相对光单位，表示为三倍的平均值±SE。MeCP2载体引起显著刺激(**P（P）*<0.05）仅在非甲基化启动子中，对控制载体的启动子活性进行刺激。

图4
MeCP2缺乏对博莱霉素治疗小鼠肺组织病理学的影响。生理盐水或博莱霉素处理的野生型代表性H&E染色肺组织切片(A类和B类）和*MeCP2型*空(C类和D类分别显示）小鼠。对每组五只小鼠进行评估，并展示代表性照片。所有照片均为×20放大倍数。

图5
MeCP2缺乏对肺纤维化指数的影响。用生理盐水或博莱霉素处理指示的小鼠菌株。采集肺部并分析羟脯氨酸含量(A类)Western blot检测I型胶原蛋白(B类)实时PCR检测mRNA(C类).答：结果以各盐水对照值的百分比表示，并显示为平均值±SE(N个= 5). MeCP2缺陷菌株的肺羟脯氨酸减少具有统计学意义(星号表明*P（P）*< 0.05).B类：每条通道代表一只动物的样本。剥离膜后，GAPDH用作负荷控制。**抄送：**实时PCR检测α1（I）前胶原mRNA，结果表达为2^-ΔΔCT，18S rRNA用作参考，盐处理野生型小鼠的水平用作校准物。数据显示为三份样品的平均值±SE。与各盐水对照组相比，差异具有统计学意义(**P（P）*< 0.05).

图6
MeCP2缺乏对肺纤维化中肌成纤维细胞分化的影响。MeCP2空（“ko”）小鼠(*MeCP2型*^−/−)和它的野生型（“wt”）室友(*甲基氯化石蜡2*^+/+)用博莱霉素或生理盐水治疗。收获后，通过Western blotting分析肺部的α-SMA蛋白(A类)实时PCR检测mRNA(B类).答：GAPDH被用作负荷控制。**B类：**结果表示为2^-ΔΔCT，以18S rRNA作为参考，以盐处理野生型小鼠的水平作为校准物。C类和**医生：**对从小鼠肺中分离的肺成纤维细胞分别进行了α-SMA蛋白和mRNA的类似分析A类和B类。数据显示为三份样品的平均值±SE。与各盐处理对照组的统计显著差异(**P（P）*< 0.05).

图7
MeCP2缺乏对TGFβ反应的影响。小鼠肺成纤维细胞分离自*MeCP2型*无鼠标(*MeCP2型*^−/−)和它的野生型室友(*MeCP2型*^+/+). 用TGFβ以4 ng/mL或缓冲液处理48小时(A类)或6小时(B类)分别是。然后通过蛋白质印迹分析总蛋白和总RNA的α-SMA基因表达(A类)和实时PCR分析(B类). 条形图的平均值±SE为N个= 3. 与各自野生型对照的统计显著差异(**P（P）*< 0.05). TGFβ治疗对野生型和MeCP2缺陷细胞的影响具有统计学意义。

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1. Darby I.A.，Hewitson T.D.伤口愈合和纤维化中的成纤维细胞分化。Int Rev细胞。2007;257:143–179.-公共医学
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