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.2011年6月；105（6）：2772-80。
doi:10.1152/jn.00494.2010。 Epub 2011年3月23日。

Kv1.3通道调节孤束核内的突触传递

安吉丽娜·拉米雷斯-纳瓦罗 1, 帕特里夏·A·格拉泽布鲁克, 米歇尔·凯恩·萨顿, 卡罗琳·帕德罗, 大卫·D·克莱恩, 黛安娜·L·昆泽
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Kv1.3通道调节孤束核内的突触传递

安吉丽娜·拉米雷斯-纳瓦罗等。 神经生理学杂志. 2011年6月.

摘要

据报道，电压门控K（+）通道Kv1.3可以调节中枢和外周神经元的递质释放。在这项研究中，我们评估了它在内脏感觉传入和孤束核（NTS）次级神经元之间的突触中的作用。我们使用RT-PCR和Western blot分析鉴定了大鼠结节神经节中Kv1.3的mRNA和蛋白。在免疫组织化学实验中，抗Kv1.3免疫反应在结节神经元胞体的内部细胞器中非常强烈，在质膜附近分布较弱。抗Kv1.3抗体也在中枢投射的轴突分支中发现，包括内侧NTS和连合NTS的突触前终末。在电流灯实验中，Kv1.3的高亲和力阻滞剂margatoxin（MgTx）使C型神经元的动作电位持续时间增加，而不是a型或Ah型神经元。为了评估Kv1.3在突触前终末的作用，我们检测了MgTx对NTS脑片中束诱发的单突触兴奋性突触后电流（EPSCs）的影响。MgTx增加了神经元亚群中诱发的EPSC的振幅，主要增加发生在20 Hz序列的第一次刺激期间。这些数据以及染色体记录的结果支持这样的假设，即Kv1.3调节C纤维突触前末端动作电位的持续时间，限制突触后细胞释放递质。

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数字

图1。
图1。
检测Kv1.3α亚基。A类：从大鼠结节神经节（NG）或带有Kv1.3特异性寡核苷酸的脑poly-A+RNA中制备有（+）或无（−）逆转录酶（RT）的第一链cDNA扩增产生的PCR产物通过电泳分离并转移到尼龙膜上。Southern杂交后32P-标记的特异性内部低聚物，放射自显影显示阳性信号来自+RT通道中的大鼠结节和大脑，而控制-RT通道中没有信号。寡核苷酸探针扩增792 bp的cDNA。B类：使用Kv1.3 cDNA样本测试引物的特异性。从NG cDNA中扩增出一条预测大小（792 bp）的单条带(车道2)，Kv1.3 cDNA(车道3)和孤束核（nTS）cDNA(车道4). 阴性对照通道（H）中未检测到PCR产物2O；车道5). 泳道1是一个1kb的DNA阶梯。C类：对NG中Kv1.3蛋白进行Western blot分析。Kv1.3受体在出生后分离的NG的蛋白裂解物中得到鉴定第1天（P1；50μg）和出生后第36天（P36；20μg）大鼠。在两种裂解液中均检测到～65 kDa的条带。蛋白质的移动性与已经报道的Kv1.3α-亚基的分子大小相关（~65kDa）。Western blot分析还表明，新生儿Kv1.3蛋白的含量低于老年动物。
图2。
图2。
Kv1.3在NG和主动脉减压神经（ADN）中的免疫组织化学定位。A类：出生后抗Kv1.3（Neuromab）免疫标记第30天Spraque-Dawley大鼠结节切片。图像是一个质量z（z）-以0.69-μm的间隔获得的五个共焦截面的投影。校准棒=30μm。这个插入显示了放大的图像，以说明膜附近/膜处较弱的标记。B类：直方图显示了抗Kv1.3标记的广泛分布，与总人口中的直径分布相比，具有相应的神经元直径。C类：ADN切片与抗Kv1.3（Alomone；红色）和抗髓鞘碱性蛋白（MBP；绿色）结合，以说明Kv1.3在有髓轴突中的存在。箭头表示反Kv1.3标签的示例。这些结果是从两只动物的ADN中获得的。注意只有两个大直径轴突。在其他五个ADN中也获得了类似的结果（2-3个直径>2μm的大轴突）。比例尺=2μm。D类和E类：用Kv1.3抗体（红色；D类)和抗MBP（绿色；E类). 覆盖层(F类)显示神经节中有髓和无髓轴突中存在Kv1.3抗体。比例尺=20μm。
图3。
图3。
标有Kv1.3的NTS的共焦图像。A类：连合区水平NTS截面的共焦图像。孤束（TS）中的细纤维离开束并支配束内侧的神经元。B类：NTS水平截面的共焦图像，显示NTS内侧核（mNTS），压力感受器轴突的终止位置。用抗Kv1.3抗体（红色）对两个切片进行的免疫染色显示，该蛋白存在于肠道和神经末梢的纤维中，但不存在于细胞体中。图像是12到15个的堆栈z（z）-以0.3-μm的间隔采集截面。比例尺=15μm。C–E类：TS和内侧NTS中抗Kv1.3和抗囊泡谷氨酸转运体2（vGlut2）的共焦图像。C类：Kv1.3抗体存在于传入感觉纤维束（TS）和离散的bouton样结构中（箭头所示）。D类：vGlut2免疫反应性存在于相同的结构中。E类：Kv1.3（红色）和vGlut2（绿色）的合并图像。每个图像都是四个图像的堆栈z（z）-部分。比例尺=20μm。其他四只动物的NTS中也有类似的抗Kv1.3标记。
图4。
图4。
Margatoxin（MgTx）产生部分总钾+结节神经元胞体中的电流A类：总向外K的示例+每20 s从−80到+40 mV去极化100 ms的神经元记录的电流。当控制迹线（实心黑线）稳定至少2 min时，施加500 pM MgTx，电流减小到所示值（红色虚线）。差异（MgTx敏感）电流显示为蓝色虚线。这个插入显示另一个神经元MgTx阻滞（↑）和恢复（↓）的时间进程。B类：在没有MgTx的情况下对另一个结节神经元施加900 ms的斜坡刺激，然后施加500 pM MgTx（↓）。减去的MgTx敏感电流激活的正电流大于−30 mV(插入).
图5。
图5。
MgTx对神经元放电的影响。A类：A型神经元示例（Na+TTX阻断的电流）对20 Hz下发出的10个短暂（0.35–1.5 ms）刺激作出响应。动作电位持续时间随频率无变化，MgTx（1 nM）对持续时间也无影响。然而，长期刺激(顶部嵌入)在MgTx（红色虚线）存在的情况下，从控制溶液中的一个动作电位（实心黑线）放电增加到重复放电，或增加恒定电流刺激的去极化幅度(底部嵌入). 比例尺英寸插入=50毫秒，10毫伏。B类：在对照溶液和MgTx存在的情况下，对10个刺激中的每一个，为3个A型神经元绘制的0 mV动作电位的平均持续时间。一组6个Ah型神经元也对MgTx无反应。C类：MgTx使C型动作电位变宽，但没有消除动作电位的刺激依赖性延长（20-Hz刺激），如对照溶液和1.0 nM MgTx存在时所示。左侧插图，控制溶液中20-Hz序列的第一动作电位（黑色），与MgTx存在时的第一动作电势（红色）相比；右侧插入，无（黑色）和有（红色）MgTx系列的第10（最后）个动作电位。D类：为10个刺激中的每一个绘制的八个C型神经元在无MgTx和有MgTx的情况下动作电位的平均持续时间。其中四个神经元先前在α-树突毒素中培养，以消除MgTx对Kv1.1、Kv1.2或Kv1.6的任何影响*P（P）<0.05（成对t吨-测试）。
图6。
图6。
MgTx增强TS激发的兴奋性突触后电流（EPSCs）。A类：在对照条件下（人工脑脊液）和MgTx（20 nM）后记录的TS诱发EPSCs的典型轨迹。TS以20 Hz的频率刺激。注意TS-EPSC振幅的增加，尤其是第一次事件。所示为五次电流扫描的平均值。B类：突触事件根据其初始电流振幅进行分组。显示的数据是20个事件的平均TS-EPSC振幅，这些事件的初始振幅在控制和MgTx应用期间小于300 pA。n个= 15. *P（P）<0.05（双向重复测量方差分析）。MgTx主要在刺激序列开始时升高EPSC。C类：MgTx敏感电流中自发EPSC频率也升高。sEPSC振幅分布的累积概率（2-pA bin，左边)在MgTx中没有改变。另一方面，自发EPSC事件间期（10-ms-bin）的累积分数说明了MgTx存在时的小左移(正确的). 对整个事件样本进行分析。D类：在控制和MgTx应用期间，三个细胞的20个事件的平均TS-EPSC振幅，这些细胞的初始TS-EPSCs>300 pA，并且对MgTx的应用没有反应。注意，对MgTx敏感的EPSC振幅(B类)明显小于MgTx不敏感的NTS神经元。
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