Lysine methyltransferase G9a is required for de novo DNA methylation and the establishment, but not the maintenance, of proviral silencing

doi:10.1073/pnas.1014660108

.2011年4月5日；108(14):5718-23.

doi:10.1073/pnas.1014660108。 Epub 2011年3月22日。

赖氨酸甲基转移酶G9a是DNA从头甲基化和前病毒沉默的建立（但不是维持）所必需的

丹尼·梁朝伟¹, 凯文·B·东, 伊琳娜·马克萨科娃, 普雷蒂·戈亚尔, 鲁斯·阿帕纳, 桑德拉李, 橘真琴, 新开洋一, 伯恩哈德·莱内茨, 迪克西·L·马格尔, 法比奥·罗西, 马修·洛林茨

附属公司

PMID： 21427230
预防性维修识别码：项目经理3078371
内政部： 10.1073/pnas.1014660108

赖氨酸甲基转移酶G9a是DNA从头甲基化和前病毒沉默的建立（但不是维持）所必需的

丹尼·梁朝伟等。美国国家科学院程序. 2011.

.2011年4月5日；108(14):5718-23.

doi:10.1073/pnas.1014660108。 Epub 2011年3月22日。

作者

附属

¹加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市不列颠哥伦比亚大学医学遗传学系。

PMID： 21427230
预防性维修识别码：项目经理3078371
内政部： 10.1073/第1014660108页

摘要

组蛋白H3（H3K9me）赖氨酸9甲基化和DNA甲基化在特定基因和重复元件的转录沉默中起重要作用。这两种标记均在小鼠胚胎干细胞（mESCs）的I类和II类内源性逆转录病毒（ERV）上检测到。最近，我们报道了H3K9me3和mESCs中ERV沉默的维持需要H3K9-特异性赖氨酸甲基转移酶（KMTase）Eset/Setdb1/KMT1E。相反，G9a/Ehmt2/KMT1C是可有可无的，尽管H3K9二甲基化（H3K9me2）和这些逆转录元件的有效DNA甲基化需要这种KMTase。外源性逆转录病毒（XRV）Moloney小鼠白血病病毒的转录在mESCs整合后迅速消失，伴随着DNA的从头甲基化。然而，H3K9 KMT在这一过程中发挥的作用尚未得到解决。在这里，我们证明了G9a，而不是Suv39h1或Suv39h2，是在mESCs中沉默新整合的基于Moloney小鼠白血病病毒的载体所必需的。G9a（-/-）细胞的沉默缺陷伴随着前病毒LTR处H3K9me2的减少，表明XRV是G9a的直接靶点。此外，G9a（-/-）系中新整合前病毒的从头DNA甲基化受损，Dnmt3a缺陷mESCs中观察到的前病毒DNA甲基化现象和沉默缺陷。然而，一旦建立，XRV（如ERV）沉默的维持就完全依赖于KMTase Eset。综上所述，这些观察结果表明，在mESCs中，H3K9 KMTase G9a是建立新整合的前病毒沉默所必需的，但不是维持沉默所需的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
逆转录病毒载体和感染模式。(A类)MFG-GFP和MSCV-GFP逆转录病毒载体5′区的图谱。干细胞专用消声器与制造商绑定/tRNA^赞成PBS，但不是MSCV/tRNA^格林PBS公司。强调了序列差异。(B类)用MFG-GFP或MSCV-GFP感染mESCs并传代以进行进一步分析。

**图2。**
*G9a公司^−/−*mESCs显示MLV前病毒沉默的缺陷。(A类)TT2（重量）和*G9a公司*^−/−mESCs感染MFG-GFP（MFG），并在第12PI进行流式细胞术分析。对未感染的细胞进行平行分析。数据表示为前向散射（FSC）与GFP。(B类)通过流式细胞术分析连续时间点PI的GFP表达。(C类和D类)TT2和*G9a型*^−/−用MSCV-GFP感染mESCs并进行流式细胞术分析。

**图3。**
引入WT，但不引入催化活性G9a，可以弥补沉默缺陷，而*Dnmt3a型*^−/−mESCs显示前病毒沉默的缺陷，类似于在*G9a公司*^−/−细胞。(A类)TT2（重量）和*G9a公司*^−/−表达a的细胞*G9a公司*转基因(*G9a公司*^−/−*Tg（千克）*)或一个催化无效的转基因(*G9a公司*^−/−*变压器C1168A*)与MSCV-GFP同时感染，并通过流式细胞术分析连续时间点的GFP表达，PI。通过qPCR使用特异性引物测定前体负荷*GFP公司*基因与内源性*β-主要*基因作为对照，每个感染人群的相对平均（±SD）前病毒拷贝数/细胞归一化为相应的感染WT亲本系。(B类和C类)J1（重量），*Dnmt3a型*^−/−、和*Dnmt3b型*^−/−多功能电子稳定控制系统(B类)或R1（WT）和*Suv39h1/2型*^−/−(C类)同时感染mESCs并分析GFP表达和前病毒载量。

**图4。**
H3K9me2在前驱LTR降低*G9a公司*^−/−mESC。(A类)消耗H3K9me2 inG9a公司^−/−个单元格，但不在*Suv39h1/2号*^−/−Western blot分析证实。对MSCV-GFP感染的TT2和*G9a公司*^−/−mESCs使用H3K9me2-和H3K9 me3-特异性抗体或IgG作为对照。(B类)qPCR是使用内源性特异性引物进行的*Mage-a2杂志*基因。显示了技术复制的平均浓缩水平[表示为输入的百分比（±SD）]。(C类)用针对MSCV 5′LTR和GFP区域的特异性引物扩增显示，在5′LTR5′处，H3K9me2的表达量减少*G9a公司*^−/−行。(D类)使用H3K4me2-和H3K9ac特异性抗体进行ChIP，并通过qPCR进行分析，如上所述。

**图5。**
前病毒DNA从头甲基化率在*G9a公司*^−/−和*G9a公司*^−/−*TgC1168A型*细胞。TT2、，*G9a公司*^−/−,*G9a公司*^−/−*Tg（千克）*、和*G9a公司*^−/−*TgC1168A型*mESCs感染MSCV-GFP。来自TT2和*G9a公司*^−/−(A类)或*G9a型*^−/−*Tg（千克）*和*G9a公司*^−/−*TgC1168A型*(B类)mESCs在d4和d18 PI处分离，并使用前病毒5′LTR特异性引物进行亚硫酸氢盐测序分析。每个测序分子中存在甲基化CpG，用黑色椭圆形表示，每个数据集显示甲基化Cp Gs/测序分子的平均百分比。

**图6。**
在mESCs中维持前病毒沉默不需要G9a。(A类)生成包含无声XRV的细胞的模式。(B类)的池*G9a公司*和*整定误差*用流式细胞术在d4 PI和GFP分析感染MSCV-GFP的CKO mESCs⁻在第14PI天用FACS分离细胞。(C类)GFP公司⁻池与4-OHT并行处理，以诱导*G9a型*和*整定误差*分别在删除前和删除后第7天通过FACS进行分析。平均相对前病毒载量（±SD）通过qPCR测定，所用引物针对*GFP公司*基因，标准化为*β-主要*基因(插入). (D类)从未经处理和4-OHT处理的CKO细胞中分离出RNA，并且在表达*G9a、Eset、Mage-a2*和MSCV-GFP（归一化为*β-肌动蛋白*)通过qRT-PCR测定了未处理野生型亲本的相对含量。

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