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.2011年3月15日；6（3）：e16828。
doi:10.1371/journal.pone.0016828。

BAG3直接与突变的αB-晶体蛋白相互作用以抑制其聚集和毒性

秋野久也 1, 莫塔达·纳杰姆·萨勒曼, 塞雷娜·卡拉, 哈姆·H·坎平加, 高山信一
附属公司

BAG3直接与突变的αB-晶体蛋白相互作用以抑制其聚集和毒性

Akinori Hishiya公司等。 公共科学图书馆综合版. .

摘要

bag3基因的纯合性破坏或基因突变导致小鼠和人类骨骼肌和心肌疾病的进行性肌原纤维肌病，而据报道，小热休克蛋白αB-晶体蛋白基因（CRYAB）的突变与肌原纤维性肌病有关。在这里，我们证明BAG3通过BAG3的中间结构域直接与野生型αB-晶体蛋白和αB-结晶蛋白突变体R120G结合。在体外结合试验中抑制这种相互作用的肽表明，BAG3的两个保守的Ile-Pro-Val区域参与了与αB-晶体蛋白的相互作用，这与显示BAG3与HspB8和HspB6结合的结果类似。BAG3过表达增加了αB-晶体蛋白R120G的溶解度，并抑制了其在HEK293细胞中的细胞内聚集。BAG3抑制分化C2C12小鼠成肌细胞中αB-crystallin R120G过度表达诱导的细胞死亡。我们的研究结果表明，BAG3在抑制CRYAB基因突变引起的蛋白质聚集方面具有新的功能，CRYAB是导致人类肌原纤维肌病的原因。

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数字

图1
图1。BAG3通过BAG3中间区直接结合αB-晶体蛋白。
（A）BAG3与大鼠心肌细胞αB-晶体蛋白相互作用从大鼠心脏分离心肌细胞，用腺病毒表达标记的BAG3。用抗标记抗体免疫沉淀细胞提取物，并将样品应用于SDS-PAGE。用抗αB-结晶蛋白抗体检测αB-结晶蛋白。用抗Hsc70和抗α-肌动蛋白抗体分别对同一膜进行阳性和阴性对照的印迹。未观察到肌动蛋白相互作用（阴性对照）。（B）野生型BAG3及其突变体的一级结构示意图BAG3ΔC构造缺少BAG域。BAG3ΔM1和BAG3△M2中分别删除了BAG3中间结构域和87-101和200-213的氨基酸。显示了残基87–101和200–213之间的氨基酸序列。（C）αB-晶体蛋白和BAG3的共沉淀在HEK293细胞中用αB-晶体蛋白表达标记的BAG3或突变体，并用抗标记抗体免疫沉淀细胞提取物。用抗αB-结晶蛋白抗体检测αB-结晶蛋白。用抗Hsc70抗体检测Hsc70与BAG3的沉淀。细胞提取物也用于免疫印迹分析以验证表达。（D）BAG3通过氨基酸87–101和200–213与αB-晶体蛋白相互作用在HEK293细胞中用αB晶体蛋白表达His标记的BAG3或BAG3M2，用抗His抗体沉淀BAG3。用抗αB-晶体蛋白抗体检测共沉淀αB-结晶蛋白（上面板）。用抗His抗体对相同的膜进行印迹（下图）。（E）BAG3与αB-晶体蛋白的直接相互作用左面板：与BAG3融合的GST蛋白表达于大肠杆菌纯化的融合蛋白与纯化的αB-晶体蛋白孵育，然后用GSH珠沉淀。SDS-PAGE后，用抗αB-结晶蛋白抗体检测αB-晶体蛋白。右图：实验中使用的GST融合蛋白用CBB染色进行可视化，以验证质量和数量。（F） 肽竞争分析纯化的GST或GST-BAG3与纯化的αB-晶体蛋白在存在或不存在与指定浓度的BAG3氨基酸87–101或200–213对应的肽的情况下孵育。将含有谷胱甘肽微球的沉淀样品加载到SDS-PAGE上，然后使用抗αB-晶体蛋白抗体进行免疫印迹分析。
图2
图2。BAG3识别αB-晶体蛋白的折叠状态。
（A） BAG3与突变型αB-晶体蛋白强烈结合。用标记的BAG3在HEK293细胞中表达野生型（WT）或突变型（R120G）αB-crystallin，并将细胞裂解液与抗标记抗体混合。用SDS-PAGE分析沉淀样品，使用抗αB-晶体蛋白（上面板）、标记BAG3（中面板）和肌动蛋白（下面板）。免疫沉淀前的样品也被装载以确认蛋白表达（右四车道）。（B） BAG3对突变αB-晶体蛋白的直接识别。纯化的GST或融合GST的BAG3珠与纯化的αB-晶体蛋白野生型（WT）或突变型（R120G）孵育，并进行下拉分析。用抗αB-晶体蛋白抗体检测沉淀的αB-结晶蛋白（上面板）。下面显示了用Ponceau染色的相同膜。突变的αB-晶体蛋白优先与BAG3结合。将纯化的GST、GST融合的αB-晶体蛋白野生型（WT）或突变型（R120G）与纯化的BAG3混合进行下拉分析。经SDS-PAGE后，用抗BAG3抗体检测BAG3。相同的膜被Ponceau（下面板）染色。
图3
图3。BAG3的过度表达抑制突变αB-晶体蛋白的聚集并增加其溶解度。
（A）突变体αB-晶体蛋白的聚集被BAG3清除。用野生型或突变型αB-crystallin质粒转染HEK293细胞，转染后的细胞中含有或不含有标记的BAG3。两天后，固定细胞，分别用抗αB-晶体蛋白抗体（彩色图像中为红色）和标记抗体（彩色照片中为绿色）对αB-结晶蛋白和标记BAG3进行染色。合并的图像也会显示（合并）。（B）BAG3清除了由αB-结晶蛋白突变体引起的聚集。αB-晶体蛋白染色后，计数含有αB-结晶蛋白聚集的细胞数并进行统计分析。Y轴表示显示αB-晶体蛋白聚集的细胞百分比。（C） BAG3增加HEK293细胞中突变型αB-晶体蛋白的稳定性。HEK293细胞在24孔培养皿中培养，转染αB-晶体蛋白野生型（WT）或突变型（R120G）质粒（每个0.2µg），并带有或不带有标记BAG3质粒。BAG3质粒的数量逐渐增加（0.05、0.15和0.3µg）。两天后，在裂解缓冲液A（10mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，2%SDS，10mM NaF，2mM Na三沃4、2 mM PMSF和1∶50蛋白酶抑制剂混合物），并进行超声处理。将样品加载到SDS-PAGE上，并使用抗αB-晶体蛋白（第一组）、Flag（第二组）和肌动蛋白抗体（第三组）进行免疫印迹分析。同时转染GFP质粒以监测转染效率，并用抗GFP抗体进行检测（底部面板）。（D） BAG3增加突变型αB-晶体蛋白在HEK293细胞中的溶解度。进行了上述“C”中所述的同一组转染，但使用裂解缓冲液B代替裂解缓冲液A（裂解缓冲液B；20 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，0.001%吐温-20，10 mM NaF，2 mM Na三沃4、2 mM PMSF和1∶50蛋白酶抑制剂混合物）。均质后，将样品转移到试管中，并在4°C下以14000×g离心15分钟。将上清液转移到一个新的试管中，以表示可溶性部分。对样品进行免疫印迹分析，以检测αB-晶体蛋白（第一组）、标记BAG3（第二组）、肌动蛋白（第三组）和GFP（最后一组）。（E）BAG3清除与Hsc70无关的突变αB-crystallin的聚集。用所示质粒转染HEK293细胞，并培养两天。面板#1（上部三个面板）：野生型αB-crystallin+pcDNA3空载体（模拟）。面板#2-7表示αB-crystallin R120G突变体的转染体，在每三个面板的左侧显示质粒。固定后，分别用抗αB-晶体蛋白抗体（彩色图像中为红色）和标记抗体（彩色照片中为绿色）对αB-结晶蛋白（αBCry）和标记蛋白进行染色。合并的图像也会显示（合并）。对含有αB-晶体蛋白R120G聚集物的细胞数量进行统计和统计分析。显示αB-晶体蛋白聚集的细胞百分比显示在右侧面板中。（F）上述HEK293细胞中Hsc70和BAG3蛋白的表达。用含有或不含有Flag-BAG3或Flag-Hsc70的αB-crystallin质粒转染HEK293细胞。两天后，对细胞进行裂解以进行蛋白质印迹。使用抗Hsc70抗体（Hsc70）、抗BAG3抗体（BAG3）和抗Flag抗体（Flag）验证Hsc70和BAG3蛋白在HEK293细胞中的表达水平。肌动蛋白被用作负荷控制（肌动蛋白）。Hsc70抗体检测到内源性Hsc70，如第二组左侧三条泳道所示，并且在右侧三条泳道用内源性蛋白过度表达Flag标记的Hsc70。标记抗体检测到BAG3FL（2车道和5车道）、BAG3？C（3车道和6车道）和Hsc70（4车道、5车道和6道路）。
图4
图4。BAG3减弱突变αB-晶体蛋白的毒性。
BAG3抑制αB-晶体蛋白突变引起的C2C12细胞凋亡.α在C2C12成肌细胞中表达带有或不带有标记BAG3的B-crystallin野生型或R120G，并用分化培养基培养细胞以诱导肌管分化。固定细胞后，分别用抗αB-结晶蛋白抗体和Dapi溶液对αB-结晶蛋白和细胞核进行染色。对具有典型凋亡核碎裂的细胞进行计数和统计分析。
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