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.2011年4月26日；108(17):6811-6.
doi:10.1073/pnas.1015248108。 Epub 2011年3月11日。

通过公开筛选的学术交叉受精产生了一类显著的蛋白磷酸酶甲基酯酶-1抑制剂

丹尼尔·巴乔夫钦 1, 贾斯汀·托莫尔, 安娜·斯皮尔斯, Chu Wang（王楚）, 雅各布·M·柏林, 蒂莫西·P·斯派塞, 维内利斯·费尔南德斯·维加, 彼得·蔡斯, 彼得·S·霍德, 斯蒂芬·舒勒, 丹尼尔·野村, 休·罗森, Gregory C Fu先生, 本杰明·F·克拉瓦特
附属公司

通过公开筛选的学术交叉受精产生了一类显著的蛋白磷酸酶甲基酯酶-1抑制剂

丹尼尔·巴乔夫钦等。 美国国家科学院程序. .

摘要

美国国立卫生研究院（NIH）赞助的筛查中心为学术研究人员提供了一个特殊的机会，让他们可以利用小分子探针寻找不符合制药行业当前利益或超出制药行业标准技术范围的蛋白质靶点。在这里，我们描述了一种针对这种靶点的抑制剂筛选结果，即酶蛋白磷酸酶甲基酯酶-1（PME-1），它调节蛋白磷酸酶2A（PP2A）的甲基酯化状态，并与癌症和神经变性有关。PME-1抑制剂尚未描述，我们将其归因于缺乏与高通量筛选兼容的底物分析，至少部分原因是如此。我们表明，PME-1可以通过荧光偏振活性蛋白质分析（fluopol-ABPP）进行检测，并使用该平台筛选300000多个成员的NIH小分子文库。这一筛选确定了一类不寻常的化合物，氮杂-β-内酰胺（ABL），作为有效的共价PME-1抑制剂（IC（50）值约为10 nM）。有趣的是，ABL并非来自商业供应商，而是对公共图书馆的学术贡献。我们使用竞争-ABPP表明，ABL对活细胞和小鼠中的PME-1具有极强的选择性，其中酶失活导致去甲基PP2A的大量减少。总之，我们结合了先进的合成和化学蛋白质组学方法，发现了一类ABL抑制剂，可用于选择性干扰不同生物系统中的PME-1活性。更普遍地说，这些结果说明了公共筛选中心如何作为中心，在合成化学和化学生物学实验室之间创造自发的合作机会，这些实验室有兴趣为具有挑战性的蛋白质靶点创造一流的药理学探针。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
PME-1的fluopol-ABPP分析。(A类)由LCMT1引入并由PME-1去除的PP2A可逆C末端甲基化的示意图。(B类)FP-Rh（75 nM）标记纯化的野生型PME-1（1μM），但不标记催化死亡的S156A PME-1突变体（1μM）。顶部面板：以灰度显示的荧光凝胶图像。(C类)野生型PME-1（1μM）与FP-Rh（75 nM）反应生成的氟醇信号的时间进程。在没有酶或S156A PME-1突变的情况下，未观察到信号增加。指示的45分钟时间点(Z轴′=0.77），在反应完成之前，选择用于高温超导。数据以平均值±SD表示。(D类)NIH小分子库中15000种代表性化合物的筛选数据。将FP-Rh fluopol信号降低了26.13%以上的化合物被指定为PME-1（红色方块）。
图2。
图2。
PME-1选择性ABL抑制剂的发现。(A类)MLPCN屏幕中识别为激活的四个ABL（ABL127、ABL103、ABL105和ABL107）。(B类)针对PME-1进行筛选的化合物的化学空间坐标（高占有率细胞中为红色；低占有率细胞为蓝色）。26个ABL（显示为放大的方块；所有其他化合物显示为小圆圈）位于化学空间中人口稀少的区域。化合物库化学空间的优化6维BCUT（31）可视化是使用标准的3D氢抑制描述符和多样解决方案（多样解决方案，Tripos）生成的，其覆盖范围通过压缩到优化的二维BCUT空间进行说明，如前所述（32）. (C类)通过在MDA-MB-231细胞的可溶性蛋白质组（1 mg/mL蛋白质）中使用FP Rh（2μM）的基于凝胶的竞争性ABPP评估化合物。(D类)完成PME-1 IC50MDA-MB-231细胞（IC）可溶性蛋白质组中ABL127（4.2 nM；95%置信限2.3–7.5 nM）和ent-ABL127（450 nM；95%置信限240–850 nM）的曲线50ABL103、ABL105和ABL107的曲线，见图S2). 数据以平均值±SEM表示；n个=3/组。(E类)在添加纯化的PME-1（500 nM，1 h）之前，用ABL127预处理HEK 293T蛋白质组（500 nM，30 min）阻止PP2A去甲基化，这是用识别PP2A特定甲基化状态的抗体进行免疫印迹测定的。
图3。
图3。
ABL是PME-1的共价抑制剂。(A类)提出ABL127抑制共价PME-1的机制。(B类)PME-1（500 nM）与DMSO或ABL127（5μM）孵育，每个反应分为两个部分。一个组分直接标记为FP-Rh（左面板），另一个组份进行凝胶过滤以去除游离抑制剂，然后与FP-Rh反应（右面板）以确定抑制的可逆性。(C类)MS1追踪未与ABL127加合（上图）或加合（下图）的PME-1活性位点肽。请参见SI材料和方法有关此实验的更多信息。从用ABL127（50μM，红色痕迹）或DMSO（黑色痕迹）处理过的纯化、重组PME-1（10μM）的胰蛋白酶消化液中获得痕量。
图4。
图4。
ABL127选择性地灭活PME-1并降低细胞中PP2A的去甲基形式。(A类)经ABL127（0.61–10000 nM；1 h）处理的MDA-MB-231细胞可溶性蛋白质组的凝胶竞争性ABPP揭示了PME-1的选择性阻断(B类)集成电路50值为11.1 nM。(C类)分别用DMSO或ABL127（100 nM）处理等量“轻”和“重”MDA-MB-231细胞1小时。将蛋白质组以1∶1的总蛋白比（每个0.5 mg）组合，通过ABPP MudPIT进行分析，并通过比较轻肽峰和重肽峰的强度来定量丝氨酸水解酶活性（见图S4更多SILAC ABPP-MudPIT分析）。数据以每个丝氨酸水解酶的所有可量化肽的平均值±SEM表示。(D类和E类)用ABL127（500 nM，1 h）处理MDA-MB-231和HEK 293T细胞后，脱甲基PP2A显著降低。(F类)与过度表达GFP的对照细胞相比，HEK 293T细胞中PME-1的稳定过度表达。PME-1在两种细胞系中均被ABL127（500 nM，1 h）完全抑制。(G公司和H（H）)过度表达PME-1的细胞显示PP2A甲基化降低，通过添加ABL127（500 nM，1 h）逆转。(我)在PME-1过度表达的HEK 293T细胞中，ABL127（500 nM）抑制PME-1的时间进程。对于E类和我: *对 < 0.05, **对DMSO处理的细胞与ABL127处理的细胞相比<0.01#对 < 0.05, ##对对于过表达GFP的细胞与PME-1相比，<0.01。数据以平均值±SEM表示；n个=3/组。
图5。
图5。
可点击的ABL显示了PME-1的蛋白质全选择性。(A类)ABL炔烃探针ABL112的结构。(B类)ABL112灭活PME-1（IC50=13.8毫微米；MDA-MB-231可溶性蛋白质组（1 mg/mL蛋白质）的95%置信限为6.5–29 nM），由基于凝胶的竞争性ABPP测定（参见图S5). (C类)用二甲基亚砜或ABL127培养MDA-MB-231细胞（100 nM，30分钟），然后用ABL112培养细胞（10–200 nM，2小时）。然后使用RhN对可溶性细胞蛋白质组（0.5 mg/mL）进行标准“点击”反应三（30）和ABL112标记蛋白通过凝胶内荧光扫描显示。PME-1是唯一被ABL112标记并被ABL127竞争的蛋白质。ABL112标记了一个额外的80 kDa蛋白，该蛋白没有被ABL127竞争，这表明它可能是ABL112的靶点，但不是ABL127的靶点（参见图S5). (D类)用DMSO或ABL127（100 nM）孵育小鼠脑可溶性裂解物（1 mg/mL）（30分钟）。然后再添加ABL112（10 nM）30分钟，然后通过点击化学ABPP进行分析。
图6。
图6。
ABL127在体内选择性抑制PME-1。(A类)用溶媒或ABL127（50 mg kg）治疗的小鼠脑可溶性蛋白质组的评估-1，i.p.，2小时）通过基于凝胶的ABPP。在该分析中，在FP-Rh标记之前，蛋白质组也在体外用DMSO或ABL127（2μM）处理，以确认PME-1的完全抑制。(B类)ABPP-MudPIT分析使用载体或ABL127治疗的动物大脑蛋白质组中的丝氨酸水解酶。这些数据证实了PME-1在体内的选择性失活。(C类和D类)与车辆处理的小鼠相比，ABL127处理的小鼠表现出去甲基化PP2A的减少*对 < 0.01, **对DMSO组与ABL127组相比<0.001。数据以平均值±SEM表示；n个=3/组。
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