Metabolic reprogramming by HIF-1 promotes the survival of bone marrow-derived angiogenic cells in ischemic tissue

doi:10.1182/blood-2010-11-321190

.2011年5月5日；117(18):4988-98.

doi:10.1182/bloud-2010-11-321190。 Epub 2011年3月9日。

HIF-1的代谢重编程促进缺血组织中骨髓源性血管生成细胞的存活

塞尔吉奥·雷伊¹, 罗微, 拉里萨·夏莫达, 格雷格·塞门扎

附属公司

PMID： 21389314
预防性维修识别码： PMC3100705型
内政部： 10.1182/血液-2010-11-321190

HIF-1的代谢重编程促进缺血组织中骨髓源性血管生成细胞的存活

塞尔吉奥·雷伊等。血液. 2011.

.2011年5月5日；117(18):4988-98.

doi:10.1182/bloud-2010-11-321190。 Epub 2011年3月9日。

作者

塞尔吉奥·雷伊¹, 罗微, 拉里萨·夏莫达, 格雷格·塞门扎

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所。

PMID： 21389314
预防性维修识别码： PMC3100705型
内政部： 10.1182/血液-2010-11-321190

摘要

骨髓细胞治疗缺血性心血管疾病的一个主要障碍是，移植细胞必须在缺氧、低血糖和pH值的缺血微环境中存活。我们证明，用二甲基草酰甘氨酸治疗骨髓源性血管生成细胞（BMDAC），一种α-酮戊二酸拮抗剂，可诱导低氧诱导因子1（HIF-1）活性，导致这些细胞的代谢重编程，葡萄糖摄取增加，O（2）消耗减少，乳酸生成增加，活性氧种类减少，细胞内pH升高。这些作用依赖于HIF-1，反式激活编码代谢酶和膜转运蛋白的靶基因。二甲基草酰甘氨酸处理的BMDAC在体内外和缺血组织中的低O（2）和低pH条件下具有显著的存活优势。即使BMDAC供体和缺血受体小鼠只有17个月大，基于HIF-1α的基因和细胞联合治疗也可以减少组织坏死，这表明这种方法可能对患有严重肢体缺血的老年患者有治疗作用。

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数字

图1
**DMOG通过减少凋亡和增加增殖来提高BMDAC的生存能力**（A）在内皮生长介质中，在载体或DMOG存在下培养等量的BMDAC 4天，并使用台盼蓝排除法计数活细胞**P（P）*<.001，DMOG与车辆#*P（P）*<0.001 vs时间0；双向方差分析后的Bonferroni事后检验。时间和DMOG治疗对BMDAC生存率的总体影响是显著的(*P（P）*< .001). （B）在第4天，使用流式细胞术检测藻红蛋白偶联的膜联蛋白V（膜联蛋白V-PE）阳性/7-氨基-维甲酸霉素D（7-AAD）阴性细胞（绿色矩形）的细胞凋亡。（C）碘化丙啶染色的BMDAC细胞周期分布及流式细胞术分析。数据为平均值±SEM（n=3或4）。

图2
**DMOG诱导BMDAC的转录和代谢反应**（A）BMDAC在载体（V）或DMOG（D）存在下培养。用荧光染料壬基吖啶橙（NAO）、2′，7′-二氯二氢荧光素二醋酸盐（H₂DCFDA）和2-[N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖（2-NBDG）（N=4-6）。（B）用定量PCR（n=6）测定线粒体DNA相对于核基因组DNA的含量。（C）耗氧量（JO₂)在无血清EGM2-MV培养基中悬浮的BMDAC中进行分析（n=6）。（D）对在载体或DMOG中培养4天的BMDAC中编码代谢调节因子的HIF-1靶基因进行定量RT-PCR分析（n=4-6）。ETFA和TBP不是HIF-1靶点，用作阴性对照。灰色阴影区域表示±2倍的控制。（插图）免疫印迹分析显示BNIP3、LDHA和PDK1蛋白水平。（E） BMDAC培养物的细胞外乳酸含量（n=9）。（F）用流式细胞仪分析免疫荧光法测定BMDAC中HIF-1α蛋白的表达（左面板）。灰色直方图对应于忽略初级抗体的阴性对照。数据为平均值±SEM（n=6；右侧面板）**P（P）*<.05，DMOG与车辆，按学生划分t吨在该图的所有面板中进行测试。数据为平均值±SEM。

图3
**DMOG处理的BMDAC在缺氧和酸性条件下的体外存活率增加**（A）pH和缺氧对BMDAC-D在5.6mM葡萄糖下存活的影响（▴）。培养4天后，等量的BMDAC暴露于低pH（6.4）、非缺氧（20%₂)和缺氧（1%O₂)条件。使用台盼蓝排斥法测量细胞活力。（B）低pH（6.4）和低氧（1%O）条件下葡萄糖浓度对BMDAC-V和BMDAC-D存活率的影响₂). 培养4天后，用LIVE/DEAD紫荧光染料和流式细胞术检测BMDAC活性。显示了3种葡萄糖浓度（0.56[●]、2.8[▴]和5.6mM[■]）下的存活曲线**P（P）*<.01，BMDAC-V与BMDAC-D，通过双向方差分析后的Bonferroni事后比较得出。数据为平均值±SEM（n=3-5）。

图4
**DMOG诱导与CAR活性增加和CAR亚型表达改变相关的细胞内碱化**（A）BMDAC的细胞内pH值。（B） BMDAC的细胞外pH。（C）钠的定量RT-PCR分析⁺/H（H）⁺BMDAC-D中的交换器和活性CAR亚型。灰色阴影区域表示BMDAC-D与BMDAC-V的±2倍差异：（c）表示细胞溶质；线粒体；（mb），膜结合；和（s），分泌。（D）使用比色法测量BMDAC匀浆的CAR活性，并将其归一化为蛋白质总量。（E）在低pH（6.4）、葡萄糖（0.56mM）和低氧（1%O）条件下，CAR抑制对BMDAC活性的影响₂). BMDAC与CAR抑制剂乙酰唑胺（1nM至500μM）孵育12小时；用LIVE/DEAD紫荧光染料和流式细胞术测定存活率。（A-E）细胞在分析前在载体（V）或DMOG（D）存在下培养4天**P（P）*<.05，BMDAC-V vs BMDAC-D，由学生t吨单因素方差分析后进行测试或Bonferroni事后比较。数据为平均值±SEM（n=3）。

图5
**HIF-1α功能丧失对BMDAC存活和基因表达的影响**.（A-C）骨髓细胞分离自*Hif1a型*^+/−（HET）小鼠，其在编码HIF-1α的基因座上为空（敲除）等位基因杂合子，或来自其野生型（WT）同窝小鼠，并在内皮生长介质中的非缺氧（N）或缺氧（H）条件下培养4天。测定存活细胞的百分比（A）、存活细胞的数量（B）和HIF-1靶基因的表达（C）**P（P）*与非缺氧性WT细胞相比<0.05#*P（P）*与B组和C组缺氧性WT细胞相比，<.01，经单因素方差分析后的Bonferroni事后比较。（D）定量RT-PCR分析在存在（+）或不存在（-）100nM地高辛（Dig）的情况下培养4天的BMDAC-V和BMDAC-D中HIF-1靶基因表达和细胞存活率（E）**P（P）*与不含地高辛的BMDAC-V相比，<0.05#*P（P）*与不含地高辛的BMDAC-D相比，<.01，经单因素方差分析后的Bonferroni事后比较。数据为平均值±SEM（n=3或4）。

图6
**DMOG提高缺血肢体BMDAC存活率**从接受单侧股动脉结扎的雌性小鼠的缺血和非缺血腓肠肌中分离基因组DNA。所有小鼠均注射2×10⁸术后即刻，AdCA5的pfu在缺血肢体的4个肌肉注射部位均匀分布。总计5×10⁵术后24小时静脉注射BMDACs（从雄性小鼠分离并在载体或DMOG中培养）。在注射后8、16、34和58小时收获肌肉。分离DNA并使用定量PCR对Y染色体特异性进行分析斯里基因序列。在非缺血肢体的腓肠肌中未检测到信号。衰减曲线是使用非线性回归的单相指数衰减模型构建的。根据数据计算BMDAC半衰期，载体和DMOG之间的差异具有统计学意义(*P（P）*< .05). 双向方差分析显示DMOG治疗对BMDAC生存率的总体影响具有统计学意义(*P（P）*<.01 n=每个时间点3或4只动物）。数据为平均值±SEM。

图7
**DMOG处理的BMDAC和AdCA5联合治疗可改善17月龄小鼠后肢缺血后的灌注和临床结果**（A）在股动脉结扎后的指定时间进行激光多普勒灌注成像（上、中面板）和摄影（下面板）。顶部面板显示了17个月大的雌性小鼠在左后肢股动脉结扎前后的典型扫描。使用如右图所示的假彩色标尺（灌注单位[PU]）量化血流。中间的面板显示了用生理盐水、AdCA5或联合治疗（AdCA5+BMDAC-D）治疗的小鼠的代表性随访图像。由于生理盐水和AdCA5处理的小鼠出现了严重的组织坏死，因此显示了随后发生自体截肢前的最后一个时间点（第14天[D14]）。底部面板：手术后第28天（D28）小鼠的代表性照片。（B）在后肢缺血后的指定时间（以天为单位），计算由激光多普勒灌注成像确定的平均缺血/非缺血肢体灌注比率。用生理盐水（黑色）、肌内注射AdCA5（蓝色）或肌内注射AdCA5+静脉注射BMDAC-D（绿色）治疗小鼠。术后立即注射肌肉内AdCA5，24小时后静脉注射BMDAC-D**P（P）*ANOVA后Bonferroni事后试验与生理盐水对照组相比<0.05（n=3只/组）。（C）组织损伤（左侧面板）评分如下：0表示无组织损伤；1、发绀/变色表明软组织坏死；2、失去1个或2个脚趾；3、丧失3～5个脚趾；4、全足截肢；5、整条小腿截肢；6、整条腿截肢。运动障碍（右侧面板）评分如下：0表示正常反应（足底/脚趾屈曲反应尾巴牵引）；1、足底屈曲，但不屈曲脚趾；2、无足底或脚趾屈曲；3、拖曳脚。术后28天测量运动损伤和缺血性组织损伤**P（P）*ANOVA后Bonferroni事后试验与生理盐水对照组相比<0.05（n=3只/组）。数据为平均值±SEM。

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