Loss of mitochondrial complex I activity potentiates dopamine neuron death induced by microtubule dysfunction in a Parkinson's disease model

doi:10.1083/jcb.201009132

.2011年3月7日；192(5):873-82.

doi:10.1083/jcb.201009132。

帕金森病模型中线粒体复合物I活性的丧失增强微管功能障碍诱导的多巴胺神经元死亡

Won-Seok Choi先生¹, 理查德·D·帕尔米特, 夏振贵

附属公司

PMID： 21383081
PMCID公司：项目经理3051820
内政部： 10.1083/jcb.201009132

在帕金森病模型中，线粒体复合物I活性的丧失加剧了微管功能障碍诱导的多巴胺神经元死亡

Won-Seok Choi先生等。 J细胞生物学. 2011.

.2011年3月7日；192(5):873-82.

doi:10.1083/jcb.201009132。

作者

Won-Seok Choi先生¹, 理查德·D·帕尔米特, 夏振贵

附属

¹华盛顿大学环境和职业健康科学系，神经生物学和行为研究生项目，西雅图，华盛顿州98195，美国。

PMID： 21383081
PMCID公司：项目经理3051820
内政部： 10.1083/jcb.201009132

摘要

线粒体复合体I功能障碍被认为是帕金森病模型中潜在的多巴胺神经元死亡。然而，Ndufs4基因的失活会破坏复合物I的活性，不会影响培养中或5周龄小鼠黑质致密部多巴胺神经元的存活。在Ndufs4（+/+）或Ndufs（-/-）中脑培养物中，用一种复合I抑制剂piericidin A治疗不会诱导选择性多巴胺神经元死亡。相反，另一种复合I抑制剂鱼藤酮会对多巴胺神经元产生选择性毒性，而Ndufs4失活会加剧这种毒性。我们确定微管解聚和胞质多巴胺和活性氧的积累是鱼藤酮诱导多巴胺神经元死亡的替代机制。Ndufs4基因敲除小鼠鱼藤酮对多巴胺神经元的毒性增强可能与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸积累减少导致多巴胺合成增强有关。我们的结果表明，通过突变或接触毒物，破坏微管动力学和抑制复合物I的结合可能是帕金森病的危险因素。

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数字

**图1。**
**复合物I抑制不足以诱导多巴胺神经元死亡。**从E14小鼠胚胎中培养原代中脑神经元，经5次DIV培养后用鱼藤酮或苦参素A处理。（A和B）鱼藤酮（A）或杀螨素A（B）抑制复合物I活性的剂量反应。使用极谱法（C和D）通过耗氧量测量细胞中的复合物I活性鱼藤酮，而不是毒蓖麻素A，选择性地降低TH的存活率⁺GABA上的神经元⁺神经元。值表示平均值。误差条表示SEM。n个= 3; *, P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

**图2。**
*恩杜夫斯4*失活不会导致多巴胺神经元死亡。（A） 5周龄SNpc TH免疫染色的代表性显微照片*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*老鼠。棒材，500µm。（B）删除*恩杜夫斯4*基因不会减少TH的总数⁺5周龄小鼠SNpc中的神经元(n个=每组5人）。（C）停用*恩杜夫斯4*培养基中的基因不会诱导多巴胺神经元死亡。E14中脑神经元从C57BL/6或*恩杜夫斯4^{液氧/液氧}*小鼠胚胎。将表达Cre-GFP的AAV1病毒添加到DIV 4上的培养物中，以删除*恩杜夫斯4*中的基因*恩杜夫斯4^{液氧/液氧}*细胞。TH的数量⁺病毒感染后5d对神经元进行定量。数据为平均值±SEM。n个= 3.

**图3。**
**鱼藤酮诱导的多巴胺神经元死亡是通过微管解聚介导的。**如图所示，在DIV 6上处理E14小鼠中脑神经元。（A） 5 nM鱼藤酮（而非10 nM副蓖麻素A）诱导微管断裂，这表明微管解聚。图像是治疗后9小时α-微管蛋白免疫染色的代表性显微照片。棒材，30µm。（B） Western blot分析显示，用5 nM鱼藤酮处理9小时后，游离（解聚）微管蛋白增加，而用10 nM副蓖麻素a处理后，游离微管蛋白没有增加。（C）用Western blotting分析10 nM鱼藤酮诱导微管解聚的时间过程。抗-α-微管蛋白抗体用于检测游离微管蛋白，而抗-谷氨酸-微管毒素抗体用于检测去酪氨酸、相对古老或稳定形式的微管蛋白。（D） 10 nM紫杉醇可减轻5 nM鱼藤酮24小时诱导的多巴胺神经元死亡，而5µM秋水仙碱24小时可杀死多巴胺神经元。（E）用10 nM紫杉醇联合处理细胞色素*c（c）*5 nM鱼藤酮诱导释放9 h。用ImageJ定量蛋白质带在Western blots上的相对强度（RI）。数据为平均值±SEM。n个= 3; *, P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

**图4。**
**多巴胺积累是鱼藤酮毒性的基础。**（A） 10 nM鱼藤酮8小时和5µM秋水仙碱8小时可增加细胞内总多巴胺含量，而10 nM紫杉醇共处理可阻断鱼藤酮诱导的多巴胺积累。（B）用多巴胺合成抑制剂α-甲基-对-酪氨酸（AMPT）预处理可减轻鱼藤酮诱导的多巴胺神经元死亡。在2 h前添加0.2-mMα-甲基-ρ-酪氨酸，并在5 nM鱼藤酮治疗24 h的过程中保持。数据为平均值±SEM。n个= 3; *, P<0.05；**，P<0.01。

**图5。**
**氧化应激导致鱼藤酮诱导的多巴胺神经元死亡。**（A） 5 nM鱼藤酮12小时增加TH中的ROS生成⁺神经元，这是由10 nM紫杉醇的共同处理所阻止的。（B） 0.5 mM的共处理N个-抗氧化剂乙酰半胱氨酸（NAC）可降低24小时5-nM鱼藤酮诱导的TH⁺神经元死亡。数据为平均值±SEM。n个= 3; *, P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

**图6。**
*恩杜夫斯4*-多巴胺缺乏的神经元对鱼藤酮和秋水仙碱更敏感。从单个E14培养中脑神经元*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*胚胎。（A） 10 nM派ericidin A持续24小时不会导致多巴胺神经元死亡*恩杜夫斯4^+/+*或*恩杜夫斯4^−/−*文化。（B） 5 nM鱼藤酮9小时后，游离（解聚）微管蛋白的增加程度与*恩杜夫斯4^−/−*文化*恩杜夫斯4^+/+*文化。用ImageJ定量Western blots上微管蛋白条带的相对强度（RI）。（C） 5 nM鱼藤酮24小时杀死更多*恩杜夫斯4^−/−*多巴胺神经元比*恩杜夫斯4^+/+*个。（D） 5µM秋水仙碱24小时对多巴胺神经元产生更大的毒性*恩杜夫斯4^−/−*比来自*恩杜夫斯4^+/+*胚胎。数据为平均值±SEM。n个= 3; *, P<0.05；**，P<0.01。

**图7。**
**NADH和多巴胺积累是*恩杜夫斯4^−/−*神经元对鱼藤酮的反应。**从单个E14培养中脑神经元*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*胚胎。（A）删除*恩杜夫斯4*该基因增加了细胞内基础NADH含量。（B） 8-h 10-nM鱼藤酮诱导的细胞内多巴胺积累在*恩杜夫斯4^−/−*文化比*恩杜夫斯4^+/+*文化。（C） 10 nM紫杉醇抑制8-h 10-nM鱼藤酮诱导的多巴胺在两种药物中的积累*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*文化。（D） 0.2-mMα-甲基-ρ-酪氨酸（AMPT）预处理可保护从两者培养的多巴胺神经元*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*胚胎对抗5-nM鱼藤酮毒性24小时。数据为平均值±SEM。n个= 3–4; *, P<0.05；**，P<0.01。

**图8。**
**ROS生成在小鼠超敏反应中的作用*恩杜夫斯4^−/−*神经元对鱼藤酮的反应。**从单个E14培养中脑神经元*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*胚胎。（A） 5 nM鱼藤酮8 h后，培养的多巴胺神经元细胞内ROS显著增加*恩杜夫斯4^−/−*胚胎比那些来自*恩杜夫斯4^+/+*胚胎。（B） 10 nM紫杉醇可防止8-h 5-nM鱼藤酮诱导的ROS生成*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*文化。（C） 0.5毫米N个-乙酰半胱氨酸（NAC）保护从两者培养的多巴胺神经元*恩杜夫斯4^+/+*和*恩杜夫斯4^−/−*胚胎对抗5-nM鱼藤酮毒性24小时。数据为平均值±SEM。n个= 3–4; *, P<0.05；**，P<0.01。

**图9。**
**鱼藤酮增加胞浆中多巴胺的积累，表明它可能抑制VMAT2活性。**（A和B）E14小鼠中脑培养物用10 nM鱼藤酮处理8 h或0.2µM利血平处理8 h。从突触体（囊泡；A）和细胞溶质部分（B）测量多巴胺浓度。（C） VMAT2的异位表达保护多巴胺神经元免受鱼藤酮的伤害。E14小鼠中脑培养物在5-nM鱼藤酮治疗24 h前2 d感染表达VMAT2的腺病毒或对照GFP病毒⁺计数神经元数量。数据为平均值±SEM。n个= 3; *, P<0.05。

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