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.2011年3月4日；144(5):782-95.
doi:10.1016/j.cell.2011.02.031。

Yap1在α-连环蛋白下游发挥作用以控制表皮增殖

卡琳·施莱格尔米尔奇 1, 莫瓦里德·莫赫塞尼, 奥克泰·基拉克, 简·普鲁沙克（Jan Pruszak）, J雷纳托·罗德里格斯, 大王周, 布里奇特·T·克雷格, 瓦莱拉·瓦西奥金, 约瑟夫·阿夫鲁奇, Thijn R Brummelkamp公司, 费尔南多·卡马戈
附属公司

Yap1作用于α-catenin下游以控制表皮增殖

卡琳·施莱格尔米尔奇等。 单元格. .

摘要

在发育和再生过程中，组织特异性干细胞的增殖受到严格控制，以产生预定大小的器官。这一过程的分子决定因素尚不清楚。在这里，我们研究了Hippo信号通路的转录效应器Yap1在皮肤生物学中的功能。通过获得和失去功能的研究，我们表明Yap1是表皮干细胞增殖和组织扩张的关键调节剂。Yap1通过与TEAD转录因子的相互作用调节这种效应。此外，我们的研究表明，α-连环蛋白是Yap1的上游负调控因子，它是一种以前参与皮肤肿瘤抑制和细胞密度传感的分子。α-catenin通过调节其与14-3-3和PP2A磷酸酶的相互作用来控制Yap1活性和磷酸化。总之，这些数据确定Yap1是表皮干细胞增殖能力的决定因素，也是哺乳动物皮肤中“人群控制”分子回路的重要效应器。

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数字

图1
图1。Yap1激活导致表皮干细胞扩张
一E18.5小鼠野生型表皮免疫组织化学染色显示Yap1表达（棕色）。B类Yap1的免疫荧光染色显示了人角质形成细胞中的动态定位模式，该模式依赖于细胞密度。C类H&E染色显示，在多西环素（Dox）诱导8天后，成年Tg小鼠皮肤出现异常厚的表皮和角化过度。D-E公司，对成人表皮冰冻切片的免疫荧光分析显示，在dox诱导8天后，Tg皮肤中增殖的Ki-67阳性细胞室以及干细胞室（p63阳性，K5阳性）扩张。虚线标记表皮-皮肤交界处。F类从8天Dox治疗的Tg小鼠中分离的原代小鼠角质形成细胞的罗丹明B染色，并在喂食器上培养9天，显示表皮干细胞室显著扩张，表现为Tg皮肤中较高的集落形成效率。G公司罗丹明B染色和菌落计数显示，通过连续重复试验测量，给予Dox后，集落形成祖细胞的自我更新能力显著增加（如第2代，P2所示）。*p<0.05，**p值<0.01。比例尺代表20µm。另请参见补充图S1A–C。
图2
图2。Yap1激活导致肿瘤形成
一Dox治疗开始后14天和42天，Ctr和Tg移植物的大体形态。注意Tg 14d移植物中角化过度和毛发生长迟缓，Tg 42d移植物的皮肤溃疡和皮下肿瘤肿块。B类在Dox诱导后9天和42天，Ctr和Tg移植物的H&E染色显示来源于Tg移植物的侵袭性角质形成细胞对下层真皮的侵袭。箭头指向邻近的正常裸鼠表皮。白色虚线表示癌与正常裸皮的边界。C类免疫组织化学显示，Dox治疗9天的Tg移植物中细胞角蛋白（CK）和角蛋白6（K6）的表达。D类，经9d和42d Dox治疗的Tg移植物上Yap1的免疫组织化学显示肿瘤的上皮起源。箭头指向裸鼠表皮。电子，42天Dox诱导Tg移植物上波形蛋白（Vim）和整合素-β4（β4-int）的免疫组织化学。比例尺代表100µm。另请参见补充图S1D–H。
图3
图3。Yap1是维持表皮干细胞增殖能力所必需的
一、代表性对照（Ctr）和cKO E18.5胚胎的大体形态。注意远端肢体、眼睛和耳朵没有皮肤，整体皮肤较薄。B类E18.5小鼠的甲苯胺蓝皮肤屏障试验显示四肢、耳朵、鼻子和嘴巴没有表皮屏障。C类H&E染色显示，与Ctr相比，cKO皮肤的表皮厚度减少（用括号表示）。注意基底细胞的扁平形态和无组织的表皮结构。虚线表示表皮-皮肤交界处。D-E公司，冷冻E18.5表皮上的免疫荧光显示cKO皮肤基底细胞耗竭的迹象。注意角蛋白10（K10）阴性、角蛋白5（K5）阳性的祖细胞/干细胞渗入基底膜（β4）的数量减少。注意cKO的角质层中K5的背景染色。F类，用抗磷烯酮H3（pH3）抗体测定cKO肢体皮肤中增殖性基底细胞数量显著减少。结果代表了对3种不同动物至少5个不同领域的测量结果。G公司，E18.5皮肤中克隆形成祖细胞数量减少。罗丹明B染色和菌落计数在电镀后第八天进行，是两个独立实验的代表。数据表示为平均值±标准偏差（误差线）**p值<0.01，***p<0.005。比例尺代表20µm。另请参见补充图S2A-F。
图4
图4。皮肤中的Yap1功能通过TEAD因子介导
一，携带最小启动子（minP）上游多聚TEAD结合序列（TBS）和mCherry报告子的HaCaT角质形成细胞系对Yap1-S127A的表达有反应，而Yap1的RNAi KD下调报告子水平。用加扰对照-RNAi转染的细胞在基础水平上显示报告活性。B类，TBS报告者动态模拟Yap1活动/定位。顶面板上，TBS-mCherry显示出动态荧光模式，在生长菌落边缘的角质形成细胞表达较高的mCherri水平。底部面板，报告信号在高细胞密度下显著降低。C类，在腺病毒Cre（+Cre）处理的Yap中，Yap1和TEAD1之间的物理相互作用实际上被消融液体/S79A胚胎成纤维细胞。用抗Yap1抗体进行免疫沉淀（IP），然后对TEAD1进行免疫印迹。负载控制β-微管蛋白（β-管）。D类、对照组（Ctr）和K14-Cre-Yap的大体形态液体/S79AE18.5胚胎。注意远端肢体无皮肤，皮肤较薄，基底细胞扁平。电子E18.5 K14-Cre-Yap皮肤中克隆形成祖细胞数量和增殖潜能的减少液体/S79A如用罗丹明B染色的集落分析所证明的小鼠。数据以平均值±标准差（误差条）、**p<0.01、***p<0.005表示。比例尺代表20µm。另请参见补充图S3A–C。
图5
图5。α-连环蛋白与Yap1和14-3-3相互作用
一将汇合的HaCaT细胞裂解物（输入）用于带有抗Yap1或Pu.1（Ctrl）抗体的IP和带有α-连环蛋白抗体的IP后材料。B类293T细胞与所示质粒共转染，然后用GST或FLAG-beads进行免疫沉淀（IP）。Co-IP显示全长Yap1和α-连环蛋白之间的关联，以及α-连环蛋白和YapS127A突变体之间的关联大大减弱。IB：免疫印迹，WCL：全细胞裂解物。C类钙诱导的原代人角质形成细胞分化导致Yap1易位到与α-catenin共定位的膜区域。比例尺=10uM。D类，对与α-catenin相互作用重要的Yap1结构域的表征。E–F，在存在或不存在14-3-3的情况下，体外拉下重组Yap1和α-catenin。G公司在磷酸化重组Yap1存在的情况下，体外拉下重组〈-catenin和14-3-3。H（H），Yap1和α-catenin的免疫沉淀表明生化相互作用依赖于14-3-3。所示比例尺为10µm。另请参见补充图S4A-E、S5A-B和表S1。
图6
图6。α-连环蛋白调节Yap1的定位和活性
一用EGTA破坏高融合角朊细胞中的AJ，导致治疗1分钟后Yap1核定位。B类携带TBS报告子的HaCaT或293T细胞中AJ蛋白的敲除（KD）。NF2的KD显示为阳性对照。C类融合角朊细胞中α-cat的KD导致Yap1核定位，并与其核伴侣Tead1相互作用（D）.电子，siRNA介导的高密度HaCaT培养物中α-cat的缺失导致丝氨酸127（pYap）处的Yap磷酸化损失，以及活化的Mst1/2（pMst）或Lats1/2（pLats）水平不变。F类，Ctrl和K14-Cre条件α-catenin突变（cKO）E18.5表皮中Yap1的免疫组织化学。注意cKO小鼠基底细胞和基底上细胞的核染色增强。G公司，免疫荧光检测Yap1（紫色）在体外表达GST-α-cat（绿色）的低密度角质形成细胞中的定位。过度表达α-cat的角质形成细胞显示Yap1定位于细胞与细胞接触的部位，而未转染的细胞显示细胞核染色，细胞膜上没有Yap1染色。H（H）α-catenin（α-cat-KD）的稳定敲除可促进HaCaT细胞的过度增殖，但多西环素（doxycycline，dox）诱导的α-caten-KD细胞中Yap1的KD可减缓细胞增殖速度以控制（Ctr）水平。我，α-cat在HaCaT细胞中的异位表达抑制细胞增殖（α-catOE）。这种生长抑制通过Dox诱导的Yap1S127A突变体（Yap1S127A+Dox）的表达得以缓解。数据为平均值±标准偏差（误差线），***p<0.001。比例尺为20µm（A，C）和10µm。另请参见补充图S5C-H和S6A-E。
图7
图7。α-连环蛋白结合阻止Yap1去磷酸化和活化
一，PP2Ac与α-连环蛋白缺失的HaCaT细胞中的Yap1相关。在缺乏α-catenin的情况下，Yap1和14-3-3的结合减弱。B类，Yap1在体外被PP2Ac去磷酸化。不同浓度的纯化PP2A与Sf9-纯化重组Yap1孵育30分钟。C类α-catenin的siRNA KD增加TBS报告子的激活和Yap1的去磷酸化。α-连环蛋白和PP2Ac的同时KD抑制TBS报告基因转录活性和Yap1磷酸化的增加。D类在重组14-3-3和α-catenin存在下，通过PP2Ac对Yap1进行体外去磷酸化竞争试验，对phospo-Yap水平进行Western blot分析。电子，密度依赖性和α-连环蛋白介导的Yap1激活的示意图模型。数据表示为平均值±标准偏差（误差线），**p<0.01，***p<0.001。另请参见补充图S7。
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