LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress

doi:10.1016/j.stem.2011.01.013

.2011年3月4日；8(3):267-80.

doi:10.1016/j.stem.2011.01.013。

LRRK2突变型iPSC-derived DA神经元对氧化应激的敏感性增加

下南阮¹, 人布莱克·拜尔斯, 布兰登绳索, 阿列克桑德·什切格洛维托夫, 詹姆士·拜恩, 普拉奇·古杰尔, Kehkooi Kee公司, 比吉特·施维尔, 里卡多·多尔梅奇, 威廉·兰斯顿, 提奥·D·帕尔默, 蕾妮·雷霍·佩拉

附属公司

PMID： 21362567
预防性维修识别码：项目经理3578553
内政部： 2016年10月10日/j.stem.2011.01.013

LRRK2突变型iPSC-derived DA神经元对氧化应激的敏感性增加

下南阮等。细胞干细胞. 2011.

.2011年3月4日；8(3):267-80.

doi:10.1016/j.stem.2011.01.013。

作者

下南阮¹, 人布莱克·拜尔斯, 布兰登绳索, 阿列克桑德·什切格洛维托夫, 詹姆士·拜恩, 普拉奇·古贾, Kehkooi Kee公司, 比吉特·施维尔, 里卡多·多尔梅奇, 威廉·兰斯顿, 提奥·D·帕尔默, 蕾妮·雷乔·佩拉

附属

¹斯坦福大学干细胞生物学和再生医学研究所，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。

PMID： 21362567
预防性维修识别码：项目经理3578553
内政部： 2016年10月10日/j.stem.2011.01.013

摘要

帕金森病（PD）的研究因缺乏接触受影响的人类多巴胺能（DA）神经元的途径而受到阻碍。在这里，我们报告了在富含亮氨酸重复激酶-2（LRRK2）基因中携带p.G2019S突变（G2019S-iPSCs）的诱导多能干细胞的产生，这是最常见的PD相关突变，以及它们分化为DA神经元。LRRK2突变的高外显率及其与散发性PD的临床相似性表明，这些细胞可以为疾病分析和药物开发提供有价值的平台。我们发现，来自G2019S-iPSCs的DA神经元的关键氧化应激反应基因和α-突触核蛋白表达增加。与对照DA神经元相比，突变神经元对暴露于应激因子（如过氧化氢、MG-132和6-羟基多巴胺）引起的胱天蛋白酶-3激活和细胞死亡也更敏感。这种增强的应激敏感性与对早期PD表型的现有认识一致，并代表了潜在的治疗靶点。

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数字

**图1。携带*第G2019S页*LRRK2突变**
（A）多能性标记物重编程和后续表达期间iPSC集落形成的进展：碱性磷酸酶（AP）、OCT4、NANOG、LIN28、SSEA3、TRA1-60、TRA1-81、SSEA4，SSSEA1大多为阴性。细胞核用DAPI（蓝色）复染。dpt=转导后第天；比例尺=100µm。（B）体外G2019S-iPSCs向代表每个生殖层的细胞分化：α-胎蛋白（AFP，内胚层）、β-Ⅲ-管蛋白（外胚层），α-平滑肌肌动蛋白和结蛋白（中胚层）以及VASA和STELLA（生殖细胞前体）。此外，在相位显微镜下很容易观察到神经元、跳动的心肌细胞和色素细胞。（C）体内G2019S-iPSCs（克隆6c1和6c3）的（畸胎瘤）分化具有所有三个胚层的证据：肠样上皮（内胚层）、软骨和肌肉（中胚层）和神经样组织（外胚层）。比例尺=100µm。（D）甲基化分析*华侨城4号*和*NANOG公司*发起人。开环和闭环分别代表非甲基化和甲基化CpG岛。（E）基因组DNA测序显示纯合子的存在*第201页*皮肤成纤维细胞（HUF6）和G2019S衍生iPSCs发生突变，但正常的HUF5皮肤成纤维或iPSCs没有突变。（F） G2019S-iPSCs（克隆6c3-iPSCs）的光谱核型分析（SKY）。（G）诱导多能干细胞和分化的35天神经元中内源性（En.）和外源性（Ex.）重编程因子的基因表达。HUF5-4F为阳性对照，病毒转导3天后收集RNA；HUF5和HUF6是非转导的人类皮肤成纤维细胞。（H） iPSC的PCR分析。6c1-和6c3-iPSC（G2019S）具有三个集成的重编程因子*CMYC公司*5c2-和5c3-iPSC有四个因素*cMYC公司*有关iPSC的更多特性，请参见图S1和电影S1。

**图2。iPSC向中脑多巴胺能神经元的定向分化**
（A） iPSC衍生30至35天神经元中脑多巴胺能神经元标记物、酪氨酸羟化酶（TH）、FOXA2、PITX3和NURR1的表达。注意FOXA、PITX3和NURR1与TH的共同定位，这是mDA神经元的特征（箭头）。NESTIN和TUJ1阳性免疫反应也显示神经元的存在。比例尺=50µm。（B）多巴胺能神经元中LRRK2蛋白的表达。比例尺=10µm。（C）基于TH和FOXA2共定位，量化H9、HUF5和G2019S系35天神经元中mDA的产量。有关iPSC衍生神经元的更多特征，请参见图S2。

**图3。诱导多能干细胞分化为功能性DA神经元**
（A） HUF5-和G2019S-iPSCs产生的DA神经元中突触结合蛋白-1（syntaptotagmin-1，SYT1）的表达。比例尺=50µm。（B）典型神经元形态细胞的电生理记录示例，远离细胞簇。（C）注入不同振幅的电流（ΔI）引起的电压偏转的电流钳记录_注射=5 pA）。（D）不同膜电位（−80–+20，ΔV=10 mV，V）下净电流的电压钳记录_持有=−90毫伏）。（E）在−70 mV下测量神经元的自发突触活动。（F）HPLC测量iPSC-衍生神经元相对于TH蛋白表达的多巴胺释放总量。数据代表平均值±扫描电镜（n=2）。神经元电生理记录见表S1。

**图4。人iPSC-Derived神经元的特性**
（A） HUF5-和G2019S iPSC衍生的神经元在不同阶段的基因表达分析*在体外*区别。iPSCs和不同神经元分化阶段（14-55天）的聚类分析。铁。大脑=整个人类胎儿大脑；红色=高表达；绿色=低；黑色=零。（B）定量RT-PCR分析显示*林28*，α-突触核蛋白(*SNCA公司*)，热休克27kD蛋白1(*热休克蛋白B1*)和配对盒基因6(*PAX6*)正常HUF5-iPSC-和G2019S-iPSC-衍生神经元。基因表达标准化为*GAPDH公司*,*中央三区*,*EEF1α*和*CNNTB1公司*（基于几何平均值）。数据表示平均值±SEM（n=每个克隆3到7个生物重复）。（C）对人类皮肤成纤维细胞（HDF）、iPSCs、hESCs和来源于iPSCs和hESCs的60天神经元进行西方分析。（D）图4F中进行的western blot的图形表示。相对蛋白质丰度归一化为GAPDH。误差线表示两个独立神经元分化的标准偏差。*p<0.05。iPSC衍生神经元的RT-PCR分析见图S3。

**图5。过氧化氢对人胚胎干细胞和iPSC-Derived DA神经元的影响**
（A） H的影响₂O（运行）₂24小时和48小时后对35天的神经元进行治疗。通过在相位对比显微镜下观察和48小时后酪氨酸羟化酶（TH）的免疫染色来测量1至48小时的存活率。每个时间点的3个独立实验中至少有7–21个孔，浓度在0.01–1 mM范围内。（B）过氧化氢（H₂O（运行）₂)导致神经元变性*在体外*注意存在自发和诱导的细胞死亡，通过激活（或裂解）形式的caspase-3（CASP3）免疫荧光在所有浓度下进行鉴定。箭头表示0.1 mM H后神经元轴突退化₂O（运行）₂治疗。比例尺=100µm。（C）不同克隆的正常（野生型）H9和HUF5-iPSC与疾病G2019S-iPSC-derived DA神经元在治疗各种H₂O（运行）₂浓度。数据表示平均值±SEM（n=每个克隆3到6个孔，两个独立实验）。（D） Western分析比较了正常HUF5-iPSC-衍生神经元（5c2）和PD G2019S-iPSC-派生神经元（6c3）在不同H₂O（运行）₂神经元分化的治疗和阶段。RT-PCR分析和细胞计数参见图S4和表S2

**图6。6-羟基多巴胺对DA神经元的影响**
（A）用不同浓度的6-OHDA处理H9-、HUF5-和G2019S-iPSC衍生神经元时神经变性的表现。比例尺=50µm。（B） TH和CASP3双重阳性细胞的定量。数据表示平均值±SEM（n=每个克隆3到4个井）。（C） CASP3阳性的TH-阴性（TUJ+）神经元的量化。数据表示平均值±SEM（n=每个克隆3到4个井）。RT-PCR分析和细胞计数也参见图S5和表S3。

**图7。ROCK抑制剂Y-27632对患者源性DA神经元的影响**
（A） H9、HUF5和G2019S-iPSC衍生神经元经神经毒素治疗后的神经变性表现₂O（运行）₂和MG-132以及岩石抑制剂Y-27632。比例尺=50µm。（B） TH和CASP3双重阳性细胞的定量。数据表示平均值±SEM（n=每个iPSC克隆2–3个孔；平均3个HUF5克隆和2个G2019S克隆）。（C）如上所述，治疗后TH-阴性（TUJ+）神经元的定量也为CASP3阳性。数据表示平均值±SEM（n=每个克隆2到3个井）。细胞计数见表S4。

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