跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年5月；85(9):4198-211.
doi:10.1128/JVI.02179-10。 Epub 2011年2月23日。

内体在猴病毒40进入和感染中的作用

萨布丽娜·恩格尔 1, 托马斯·海格, 罗伯塔·曼奇尼, 法比安·赫尔佐格, 尤根·卡滕贝克（Jürgen Kartenbeck）, 阿诺德·海耶, 阿里·海伦纽斯
附属公司

内体在猴病毒40进入和感染中的作用

萨布丽娜·恩格尔等。 J维罗尔. 2011年5月.

勘误表in

摘要

猴病毒40（SV40）与细胞表面受体神经节苷脂GM1结合后，通过脂筏介导的内吞作用被内吞，并缓慢运输到内质网，在那里发生部分脱膜。我们通过使用靶向小干扰RNA（siRNA）沉默屏幕、电子显微镜、活细胞成像以及测试各种细胞抑制剂和其他干扰物，分析了病毒在HeLa和CV-1细胞中的细胞内途径。我们发现，病毒在到达内质网之前进入早期内体、晚期内体，可能还进入内溶体，并且该途径是感染途径的一部分。该病毒对抑制内体酸化和成熟的各种扰动特别敏感。我们先前的模型假设病毒通过富含小窝蛋白的细胞器（我们称之为小窝小泡体），与此相反，我们得出结论认为SV40依赖于经典的内吞途径进入感染。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
内部化SV40与内体标记物共定位（另请参阅补充材料中的电影S1至S3）。（A） CV-1细胞与SV40-AF488在37°C下孵育120分钟。用EE标记物EEA1的抗体混合细胞并进行免疫染色。使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜系统对共聚焦切片进行成像。（B到D）将荧光标记的SV40添加到转染有不同XFP标记的内体标记的CV-1细胞中，并在指定的时间点用旋转圆盘共焦显微镜实时成像（C除外，C是用蔡司LSM 510系统成像的）。（E） 升温后不同时间与标记Rab7-EGFP和Rab5-mRFP共定位的病毒百分比。它是根据D中显示的图像计算得出的。误差条是三个不同实验中5到15个细胞每个时间点数据平均值（SEM）的标准误差，每个细胞平均50到100个颗粒。（F） 与A相同，但用SV40-AF594孵育细胞，并用LE标记LAMP1染色。
图2。
图2。
内化SV40与EE和LE标记物的配色（另请参阅补充材料中的电影S4）。（A和B）SV40-AF647被添加到转染Rab7-mRFP和LAMP1-EGFP或Rab9-EYFP的CV-1细胞中，并在升温后153分钟用旋转圆盘共焦显微镜成像。（C） 荧光标记的SV40内化到转染有组成活性突变体Rab5Q79L-EGFP的CV-1细胞中，并在加热后160分钟用共焦显微镜实时成像。（D） 将荧光标记的右旋糖酐添加到CV-1细胞中2 h，培养过夜，并将其置于SV40-AF647中，在冰上结合2 h。在加热至37°C后240 min，用共焦显微镜对细胞成像。
图3。
图3。
SV40进入内胚体结构和内质网。（A）通过阴性染色观察纯化的SV40。（B至G）纯化的病毒在加热后的不同时间与CV-1细胞孵育，固定，包埋在塑料中，切片并成像。箭头指向单个病毒颗粒。病毒被视为单个颗粒（A），存在于质膜（B）、内胚体结构（C至F）和内质网（G）的光滑区域内。E中的字母E代表“内体”。比例尺表示200纳米。
图4。
图4。
内化和感染的酸依赖性。（A） 用100nM巴非霉素A预处理CV-1细胞1小时1（Baf），20 mM NH4Cl或10μM莫能菌素（Mon），并在药物持续存在的情况下感染SV40 24小时（MOI为1）。通过SV40 T抗原的免疫染色和流式细胞术测定感染水平，并将其归一化为无药对照。（B） 用SV40（MOI为1）感染细胞，并在不同时间向细胞中添加Baf。如上所述确定A的感染。（C）与A相同，但使用小鼠成纤维细胞小窝蛋白-1敲除细胞和Baf。所示数据表示三个独立实验数据的平均值±SEM，每个实验都有三份样品（A到C）。（D） NH存在下内化SV40颗粒的百分比4Cl、Baf和Mon。误差条显示了三个不同实验中5到15个细胞每个时间点的SEM，每个细胞的平均颗粒数为50到100。升温后不同时间，在Mon（E和F）和Baf（G和H）存在下，用SV40粒子孵育CV-1细胞的（E到G）EM图像。箭头指向病毒颗粒。比例尺指示200 nm。
图5。
图5。
内化分析。（A） 在加入荧光标记的SV40前20 h，用Rab7-mRFP转染CV-1细胞。将细胞在冷环境中培养1小时，冲洗掉未结合的病毒，然后立即将细胞转移到显微镜上。五z（z）在加入台盼蓝熄灭细胞外荧光之前（洗涤后10min）和之后（洗涤后15min），用旋转圆盘共焦显微镜对每个细胞的切片进行成像。（B） 与A相同，但细胞在37°C下孵育240分钟后熄灭（244分钟）。（C） 与A相同，但在37°C下与病毒孵育240分钟之前和期间，细胞预先与Baf孵育1小时。
图6。
图6。
真空pH值升高会抑制SV40的贩运（另请参阅补充材料中的电影S5和S6）。（A、C和D）SV40-AF647与转染XFP标记蛋白和100 nM巴非霉素A的细胞孵育1（Baf），20 mM NH4添加Cl或10μM莫能菌素；在加热后的不同时间点用共焦显微镜对细胞进行成像。注意NH4Cl和莫能菌素引起内体和溶酶体肿胀，Baf导致内体失去圆形外观。（B） 在100nM Baf存在下，在加温后的不同时间点与标记物Rab7-EGFP和Rab5-mRFP共定位的病毒的百分比，根据如A中所示的图像计算。误差条是来自三个独立实验的5-15个细胞的每个时间点的数据的SEM，平均每个细胞有50-100个颗粒。
图7。
图7。
SV40通过晚期内体途径和到达内质网的分子要求。（A）与模拟治疗对照组相比，在5μM诺卡唑（Noc）存在下内化的SV40颗粒的百分比。（B和C）SV40颗粒在5μM诺卡唑存在下加入CV-1细胞4小时的EM图像。黑色箭头表示病毒。（D） SV40-AF647与转染Rab7-mRFP和Rab5-EGFP的CV-1细胞在5μM诺卡唑的持续存在下孵育。显示了230分钟后拍摄的代表性细胞的共焦切片。（E） 在5μM诺卡唑存在下，升温后不同时间点与Rab7-mRFP和Rab5-EGFP共定位的病毒颗粒百分比，如D中所示的图像所量化。误差条是三个不同实验中5至15个细胞每个时间点数据的SEM，每个细胞平均有50到100个颗粒。（F） 用5μM诺卡唑孵育的CV-1细胞在5μM的MOI下感染SV40 24 h。在升温后8 h清洗药物，或在清洗后添加不同的药物。感染水平通过SV40 T抗原的免疫染色和流式细胞术标准化为无药对照来确定。所示为三个独立实验数据的平均值±SEM，每个实验都有三份样品。缩写：Baf，bafilomycin A1; Mon，莫能新；BFA，布雷费尔丁A；OV，原钒酸盐；Gen，染料木素；OA、冈田酸；钙蛋白C；戴恩，戴纳索尔。（G） 与模拟处理对照组相比，在80μM dynasore存在下内化的SV40颗粒的百分比。
图8。
图8。
感染性SV40进入CV-1细胞的模型。SV40与受体（GM1）结合，分裂成脂筏，通过小窝介导或小窝蛋白-1非依赖性脂筏依赖性内吞机制诱导质膜内化。病毒被转移到Rab5-、EEA1-和Hrs-阳性的EE。当这些内体获得Rab7时，SV40与Rab7阳性结构域结合。通过内体成熟，病毒成为LAMP1-、Rab9-和Rab7-阳性LEs的内腔成分，最终成为内溶体。液泡ATP酶（v-ATP酶）负责内体和溶酶体的酸化。SV40内化和后续运输步骤需要酸化。病毒通过一种未知机制直接或不太可能通过高尔基复合体从内吞途径的晚期腔室转移到内质网。进入途径中的早期和晚期事件可被各种抑制剂和其他扰动物阻断。参考文献中报道的不同药物的作用。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Allander T.等人，2007年。第三种人类多瘤病毒的鉴定。J.维罗尔。81:4130–4136-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anderson H.A.、Chen Y.、Norkin L.C.，1996年。结合猴病毒40转位到富含小窝蛋白的膜域，其进入受到选择性破坏小窝的药物的抑制。分子生物学。手机：7:1825-1834-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Aniento F.、Emans N.、Griffiths G.、Gruenberg J.，1993年。细胞质动力蛋白依赖的小泡从早期到晚期的内体运输。细胞生物学杂志。123:1373–1387-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ashok A.，Atwood W.J.，2003年。JC病毒和猿病毒40感染人类胶质细胞时，胞内pH值和细胞骨架的对比作用。J.维罗尔。77:1347–1356-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baravale G.等人，2005年。转铁蛋白循环和右旋糖酐向溶酶体的转运受巴非霉素、诺卡唑和低温的不同影响。细胞组织研究320:99-113-公共医学

出版物类型

LinkOut-更多资源