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.2011年4月6日；30(7):1335-42.
doi:10.1038/emboj.2011.41。 Epub 2011年2月22日。

Cas3是CRISPR/Cas免疫系统中的单链DNA核酸酶和依赖ATP的解旋酶

托马斯·辛库纳斯 1, 吉德利乌斯·加斯乌纳斯, 克里斯托夫·弗雷莫克斯, 鲁道夫·巴兰古, 菲利普·霍瓦思, 弗吉尼亚州西克斯尼
附属公司

Cas3是CRISPR/Cas免疫系统中的单链DNA核酸酶和依赖ATP的解旋酶

托马斯·辛库纳斯等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）是最近发现的一种适应性原核免疫系统，通过利用小分子导向crRNAs（CRISRP RNAs）干扰入侵病毒和质粒，提供对外来核酸的获得性免疫。在大肠杆菌中，Cas3对于crRNA引导的干扰病毒增殖至关重要。Cas3包含N末端HD磷酸水解酶和C末端超家族2（SF2）解旋酶结构域。在这里，我们提供了嗜热链球菌CRISPR4（Ecoli亚型）系统Cas3蛋白的克隆、表达、纯化和体外功能分析的首次报告。Cas3具有单链DNA（ssDNA）刺激的ATP酶活性，该活性与DNA/DNA和RNA/DNA双链体的解链有关。Cas3还显示位于HD结构域的ATP-非依赖性核酸酶活性，对ssDNA底物具有偏好性。为了剖析各个结构域的贡献，通过定点突变获得了Cas3功能分离突变体（ATP酶（+）/核酸酶（-）和ATP酶（-。我们认为Cas3-ATP酶/解旋酶结构域作为一种运动蛋白，帮助向靶向外源DNA的级联-crRNA复合物传递核酸酶活性。

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数字

图1
图1
(A类)CRISPR4/Cas系统的组织示意图嗜热链球菌DGCC7710和CRISPR/Cas系统大肠杆菌K-12。虚线连接的相应蛋白质序列之间相同和相似（括号中）残基的百分比。每个系统的保留重复序列显示在插入中。(B类)的域体系结构嗜热链球菌Cas3蛋白。由标识的域生物信息学分析结果显示为灰色方框。HD结构域表示HD型磷酸水解酶/核酸酶结构域；DExD/H结构域表示DExD/H-盒解旋酶结构域；HelC-dom表示C末端解旋酶结构域。方框上方显示了不同域的保守残基特征和丙氨酸突变。保守螺旋酶基序的位置用数字I、II和VI表示。
图2
图2
Cas3 ATP酶活性。(A类)放射性ATP酶测定。在30°C下，在含有10 mM Tris–HCl（25°C时pH7.5）、30 mM KCl、5%（v/v）甘油、2 mM MgCl的反应缓冲液中进行ATP酶反应2、0.1 mg/ml BSA、0.5 mM ATP、2.5 nM ssDNA（M13mp18）或dsDNA（pUC57质粒的超螺旋形式）和250 nM Cas3。反应混合物中添加了[α32P] ATP（5 Ci/mmol），斑点在聚乙烯亚胺-纤维素薄层板上，通过色谱分离，然后通过磷成像仪可视化。(B类)核酸的ATP水解依赖性。孔雀石绿试验通过检测ATP中释放的游离磷酸盐来测量ATP水解。上述缓冲液中的反应混合物含有不同数量的ssDNA（M13mp18）、dsDNA（pUC57质粒的超螺旋形式）或2223 nt RNA(C类)ATP水解的时间过程。反应混合物含有3 nM ssDNA（M13mp18）。孔雀石绿试验通过检测ATP中释放的游离磷酸盐来测量ATP水解。(D类)ATP水解速率。反应速率常数k个（最小值−1)根据中显示的时间进程斜率计算(C类).
图3
图3
Cas3核酸酶活性。(A类)ssDNA和dsDNA的降解。在存在（+）或不存在（-）10 mM MgCl的情况下，在37°C下，在4 nM M13 ssDNA或pUC57 dsDNA的存在下培养不同数量的Cas3 2 h2或10 mM EDTA。(B类)突变对Cas3核酸酶活性的影响。总之，500 nM蛋白质在37°C下与4 nM M13 ssDNA孵育2小时。
图4
图4
Cas3解旋酶活性和极性。(A类). 双解卷分析的示意图。(B类,C类)DNA–DNA和RNA–DNA双链通过Cas3解链。Cas3 P位移32-标记的20nt寡核苷酸(B类)或22个寡核苷酸(C类)在聚丙烯酰胺凝胶中监测退火到ssM13mp18的DNA。在30°C下，在反应缓冲液中进行反应1小时：10 mM Tris–HCl（25°C下pH 7.5）、25 mM KCl、15%（v/v）甘油、1 mM MgCl2、0.1 mg/ml BSA、2 mM ATP、0.5 nM底物和各种数量的蛋白质。nA表示ATP类似物AMP-PNP。D452A和D77A分别是ATP酶和核酸酶域突变体。(D类)Cas3极性分析I.线性M13mp18 DNA末端30 nt双链片段的Cas3置换。部分双链DNA由伊赫退火至M13pm18 DNA的标记的60nt寡核苷酸的I裂解。双链区由数千个核苷酸组成的单链区分开。反应混合物中含有500 nM的Cas3。在规定的时间间隔内停止反应。(E类)Cas3极性分析II。含有53 nt 3′-或5′-悬垂物的基于寡核苷酸的73 nt底物的Cas3置换。如图4B和C所示进行反应，不同之处在于，对于基于寡核苷酸的底物，在反应中使用500nM的Cas3、1.5nM的底物和250nM的陷阱DNA（未标记的寡核苷酸）。
图5
图5
拟议的Cas3作用机制。三元级联–crRNA–Cas3复合物与靶DNA的组装促进链分离和crRNA与互补DNA链的杂交，以产生R环结构。R环结构中的单链DNA被Cas3核酸酶切割到多个位点，导致原间隔区的单链断裂。在一条DNA链断裂后，Cas3解旋酶活性可能会进一步重塑级联–crRNA复合物，例如，通过取代级联–crRNA，并为HD结构域的第二条DNA链切割创建平台，以产生双链断裂。
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