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.2011年4月；14(4):527-32.
doi:10.1038/nn.2765。 Epub 2011年2月20日。

体内全细胞记录转染：连接单细胞生理学、遗传学和连接组学

艾德·兰茨 1, 凯文·弗兰克斯, 马丁·施瓦兹, 布鲁诺·皮克勒, 安德烈亚斯·谢弗（Andreas T Schaefer）, 特洛伊·W·马格里
附属公司

体内全细胞记录转染：连接单细胞生理学、遗传学和连接组学

Ede A牧场等。 自然神经科学. 2011年4月.

摘要

单细胞基因操作有望大大推进系统神经科学领域。然而，现有的基因传递技术不允许研究人员对细胞进行电生理学表征，从而在生理学和遗传学之间建立实验联系，以了解神经元功能。在小鼠体内大脑中，我们发现神经元在“盲”全细胞记录后保持完整，在这种记录过程中，DNA载体可以通过贴片移液管递送，并且这些载体在记录的细胞中驱动蛋白质表达至少7天。为了说明这种方法的实用性，我们在初级视皮层细胞中记录视觉诱发的突触反应，同时传递DNA质粒，允许逆行、单突触追踪每个神经元的突触前输入。通过在特定基因扰动之前提供细胞的生物物理轮廓，这种组合方法捕捉神经元的突触和解剖感受野。

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数字

图1
图1。记录方法和生物细胞回收率
一，用于监测移液管电阻的密封测试电流跟踪。b条当踩下电极时与细胞膜接触，吸管阻力的节律性变化与心跳相关运动相关联。c（c）、显示密封形成的痕迹和d日，全细胞访问。e（电子）从i中所示的电池记录的IV关系（电流注入50 pA步进600 ms）。（f），电流跟踪响应之前的电压阶跃和克，在吸管缩回期间，从而实现外部补丁配置小时。插入轨迹：细节来自小时显示单通道电流。我，生物细胞素标记的2/3层锥体细胞的形态示例（记录后29小时处死动物）。j个，根据记录的串联电阻绘制充满生物细胞的细胞回收成功率（在断裂后30秒内确定）。圆圈表示每个单元的恢复成功或失败。灰色圆圈表示不符合回缩和/或串联电阻标准的记录。红色大圆圈表示每个箱子的平均成功率（范围：20–40、41–50、53–70、71–200 MΩ）。所有误差条均为SD。数字表示各个箱子的n。虚线表示与各个数据点的线性拟合。k个，根据记录持续时间绘制细胞恢复成功率图（箱子范围：1–4、5–6、7–9和10–13分钟），以及我，记录和牺牲动物之间的间隔时间（垃圾箱范围：23–24、25–29、31–45、47–51小时）。
图2
图2。生理特性和遗传操作
一，从面板d1和d2中显示的第5层神经元记录的放电轮廓和IV关系。所示电压轨迹是对持续600 ms的50 pA电流阶跃的响应。b条，膜电压轨迹显示自发突触活动和合成动作电位的动力学。c1，突触对沿箭头（左）所示方向移动的漂移光栅的响应（平均10次扫描）。箭头（顶部）表示光栅开始漂移。二氧化碳，极坐标图显示了膜电压迹线的积分（从刺激开始1400ms）。d日，记录26小时后初级视皮层第5层锥体细胞显示GFP表达(第1天)和生物细胞标记(第2天). 请注意，由于接近记录的细胞时排出的生物细胞羽流，沿电极轨迹的生物细胞信号微弱、非特异性。e（电子）GFP信号在同一细胞的树突棘和轴突树突中表达。（f），GFP标记的细胞回收的成功率相对于记录的系列抗性作图（在插入后30秒内测定）。圆圈表示每个单元的恢复成功或失败。灰色圆圈表示不符合回缩和/或串联电阻标准的情况。绿色圆圈表示每个箱子的平均成功率（范围20-40、41-50、53-70、71-200 MΩ）。所有误差条均为SD。数字表示各个箱子的n。虚线表示与各个数据点的线性拟合。克，根据记录持续时间绘制细胞恢复成功率图（箱子范围：1–4、5–6、7–8、9–13分钟），以及小时记录和祭祀动物的时间间隔（垃圾桶范围：23–25、26–28、29–33、40–47、48–51小时）。
图3
图3。多基因传递
一，运动皮层中修补的第5层神经元在修补3天后的自然荧光图像pCAGGS-td番茄（右上角）和pCAGGS-清洁（右下各50 ng/μl），比例尺：1 mm和20μm。b条，初级体感皮层第5层细胞自然荧光图像库，用pCAGGS-DsRed2、pCAGGS-Venus和pCAGGS-ChR2-氯.比例尺：20μm。
图4
图4。视皮层神经元突触感受性映射和连通性
一，从面板d中显示的GFP表达细胞记录的放电曲线和IV关系。显示的电压轨迹是对持续600 ms的50 pA电流阶跃的响应。b条，对沿箭头（左）所示方向移动的漂移光栅的突触响应（平均10次扫描）。箭头（顶部）表示漂移开始。电流注入（−200 pA）用于从AP活动中分离诱发的突触反应。c（c），极坐标图，显示漂移光栅持续期间记录的电压轨迹积分（红色）。突触反应积分（自刺激开始1400 ms）归一化为最大反应。以下是针对最小和最大首选方向记录的5条示例记录道。对于尖峰感受野，保持电流被移除，刺激序列（b）被重复五次。d日，冠状切片（100μm厚）显示抗GFP（绿色）和抗RFP（红色）荧光。初级视觉皮层（V1）中记录的第5层神经元（绿色-黄色）和标记为mCherry的细胞（红色）可以清楚地识别。在这张切片中观察到大约200个突触前细胞。比例尺=500μm。缩写：V2ML：次级视皮层内侧，V2L：次级视皮质外侧，CA1-3：海马区CA1-3，DLG：背外侧膝状体核。e（电子），高倍图像显示V1中GFP和mCherry标记的细胞。比例尺=100μm。（f）在该切片中，DLG中观察到8 mCerry标记细胞。比例尺=50μm。克.连续100μm厚切片的五个最大强度投影。中间面板包含主机单元（绿色；比例尺：200μm）。分别在病毒注射和记录后7天和9天处死该小鼠。
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