Protein kinase C δ is a downstream effector of oncogenic K-ras in lung tumors

doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-1511

.2011年3月15日；71(6):2087-97.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-1511。 Epub 2011年2月18日。

蛋白激酶Cδ是肺肿瘤中致癌K-ras的下游效应器

詹妮弗·西蒙兹¹, 安吉拉·M·欧姆, 克里斯坦·J·卡特, 林恩·希斯利, 特蕾莎·A·波义耳, 威尔伯·A·富兰克林, 玛丽·雷兰德

附属公司

PMID： 21335545
预防性维修识别码： PMC3271733
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-10-1511

蛋白激酶Cδ是肺肿瘤中致癌K-ras的下游效应器

詹妮弗·西蒙兹等。癌症研究. 2011.

.2011年3月15日；71(6):2087-97.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-1511。 Epub 2011年2月18日。

作者

詹妮弗·西蒙兹¹, 安吉拉·M·欧姆, 克里斯坦·J·卡特, 林恩·希斯利, 特蕾莎·博伊尔, 威尔伯·A·富兰克林, 玛丽·雷兰德

附属

¹美国科罗拉多州奥罗拉市安舒茨医学院科罗拉多大学医学院癌症生物学项目，邮编80045。

PMID： 21335545
预防性维修识别码： PMC3271733
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-10-1511

摘要

K-ras的癌基因激活通常发生在非小细胞肺癌（NSCLC）中，但针对该途径的治疗策略一直很难制定。关于K-ras下游效应器的信息仍然不完整，可控制的靶点尚未确定。在本研究中，我们利用小鼠致癌物模型和人类NSCLC细胞研究了蛋白激酶Cδ（PKCδ）在K-ras依赖性肺肿瘤发生中的作用。PKCδ缺陷敲除（δKO）小鼠与野生型（δWT）小鼠相比，尿烷诱导的肺肿瘤发生率降低了69%。δKO肿瘤较小，增殖减少。DNA测序表明，所有δWT肿瘤都有激活KRAS的突变，而只有69%的δKO肿瘤有激活突变，这表明PKCδ在致癌K-ras下游起肿瘤促进剂的作用，而在其他致癌环境中起肿瘤抑制剂的作用。在一组具有致癌K-ras的非小细胞肺癌细胞系中也获得了类似的结果，但它们对K-ras生存的依赖性不同。RNA干扰介导的PKCδ衰减抑制K-ras依赖细胞中锚定非依赖性生长、侵袭、迁移和肿瘤发生。这些效应与抑制丝裂原活化蛋白激酶途径的激活有关。相反，PKCδ的衰减增强了K-ras依赖性或WT-KRAS阳性的NSCLC细胞中非依赖锚定物的生长、侵袭和迁移。出乎意料的是，我们的研究表明，PKCΔ在肿瘤细胞中的功能依赖于特定的致癌环境，因为NSCLC细胞中PKCδ的缺失仅在依赖致癌K-ras增殖和存活的细胞中抑制转化生长。

PubMed免责声明

数字

**图1。氨基甲酸乙酯诱导的δ-KO小鼠肺肿瘤发生受到抑制**
FVBδWT或δKO小鼠在无菌水中注射1 mg/kg氨基甲酸乙酯，并按照材料和方法中的描述进行处死。*（A）*20周时的肺部肿瘤/小鼠(n个=11个基因型）聚氨酯后注射。*（B）*注射聚氨酯20周后δWT和δKO肿瘤大小的量化。*（C）*20周治疗小鼠δWT和δKO肿瘤的Top、H+E染色（40X和400X）和Ki67免疫组织化学（200X）；底部，Ki67表达的量化。数据表示Ki67阳性细胞/肿瘤细胞总数+/−SEM的平均数（p<0.001）。每个肿瘤的细胞数量超过1000个；n个=17个肿瘤来自4δWT小鼠，14个肿瘤来自于4δKO小鼠。*（D）*顶部，10周时每只小鼠的肺肿瘤(n个=每个基因型7个）氨基甲酸乙酯后注射；底部，在注射氨基甲酸乙酯10周后对δWT和δKO肿瘤大小进行量化。所有实验的显著性通过双尾学生t检验确定。

**图2。PKCδ是K-Ras依赖生存的非小细胞肺癌细胞的锚定非依赖性生长所必需的**
*（A）*如图所示，使用siRNA寡核苷酸短暂耗尽PKCδ的八个NSCLC细胞中的BrdU掺入。对照细胞（δsiRNA负）用打乱的siRNA寡核苷酸处理。PKCδ的免疫印迹显示蛋白质耗竭，如下所示；剥离印迹并探测肌动蛋白。对于所有面板，显示了代表性实验的数据，该实验以一式三份+/-SEM进行。（B）和（C）：对照NSCLC细胞（scr）和表达δ193或δ203的细胞悬浮在软琼脂中，并按照材料和方法中的描述测定菌落数。*（B）*K-Ras依赖性NSCLC细胞株H2009、H727和H441。*（C）*K-Ras非依赖性NSCLC细胞系A549和H460，以及具有野生型K-Ras的H226细胞。图中显示了一个代表性实验+/-SEM中的三次测量结果；包括代表性软琼脂菌落的图片与对照组显著不同(第页<0.05）通过双尾学生t检验。显示每个细胞系PKCδ和肌动蛋白表达的免疫印迹如下图所示。每个实验重复2-6次。

**图3。在NSCLC细胞中激活Ras或PDK1/AKT不需要PKCδ**
*（A）*表达A549、H2009和H441细胞的对照组Ras活化（scr）、δ193和δ203。顶部，GTP绑定Ras的下拉；最左边，在下拉之前将GTPγS或GDP添加到细胞裂解液中。第二、第三和第四行显示总Ras、PKCδ和肌动蛋白的免疫印迹。*（B）*对由表达K-Ras非依赖性（A549和H460）和K-Ras依赖性（H2009和H441）NSCLC细胞的对照（scr）、δ193和δ203制备的细胞裂解液进行免疫印迹，以检测所示的磷酸（S241）PDK-1、磷酸（S473）AKT、磷酸（S217/221）。如图所示，剥离印迹并探测总PDK-1、AKT、PKCδ和肌动蛋白。实验重复至少4次。

**图4。PKCδ是激活K-Ras依赖生存的NSCLC细胞中MEK/ERK所必需的**
*（A）*从表达K-Ras突变的NSCLC细胞的对照（scr）、δ193和δ203制备的细胞裂解物进行免疫印迹，以检测磷酸化（S217/221）MEK1/2、磷酸化（T202/Y204）ERK1/2和磷酸化（S380）RSK90。如图所示，剥离印迹并探测总MEK1/2、ERK1/2、RSK90、PKCδ和肌动蛋白。展示了具有代表性的实验；实验重复至少4次。*（B）*pMEK1/2水平*（A）*通过密度计进行量化，归一化为总MEK1/2，并绘制相对于对照（scr）的曲线。*（C）*pERK1/2水平*（A）*通过密度计定量，归一化为总ERK1/2，并绘制相对于对照（scr）的曲线。对于（B）和（C），scr=白色条，δ193=灰色条，δ203=黑色条。*（D）*A549、H460、H2009和H441细胞感染了编码对照（Ad-lacZ）或激酶死亡（Ad-δKD）的腺病毒。制备细胞裂解物，并对磷酸化ERK1/2、ERK、肌动蛋白和PKCδ进行免疫印迹。δKD转导细胞中PKCδ蛋白的增加表明δKD的表达。这个实验重复了三次；显示了一个具有代表性的斑点。

**图5。PKCδ耗竭抑制裸鼠侵袭、迁移和肿瘤生长**
表达H2009的对照（scr）、δ193或δ203的迁移和侵袭*（A）*和A549（B）按照材料和方法中的描述对细胞进行分析。对每个过滤器计数五个场，并在一式三份的过滤器上对每个实验条件进行分析。每个实验重复三次或更多次。*（C）*裸鼠顶部注射对照H441细胞（钻石；n个=10）在左侧或H441细胞表达δ193（三角形；n个=5）或δ203（正方形；n个=5）在右侧。从第九天开始测量肿瘤。图表显示测量值+/-SEM的平均值。*=与δ203显著不同(第页<0.05);⁺=与δ193显著不同(第页<0.05).（C）底部，对肿瘤裂解物进行pERK免疫印迹，并对总ERK进行剥离和再provided，或对PKCδ进行免疫印迹并对肌动蛋白进行剥离和重新provided。显示了具有代表性的图像。(*D），*PKCδ调节K-Ras依赖性非小细胞肺癌细胞凋亡和生存途径的模型。Ras还可以通过PI3K/AKT途径激活增殖，尽管我们的研究表明这并不依赖于PKCδ。有关更多详细信息，请参阅文本。受体酪氨酸激酶；PI3K、磷脂酰肌醇3′激酶。

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