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。2011年2月7日；6（2）：e14665。
doi:10.1371/journal.pone.0014665。

靶向血管NADPH氧化酶1通过PPARα介导机制阻断肿瘤血管生成

萨拉·加里多·乌尔巴尼 1, 斯蒂芬·杰梅林, 克里斯汀·德弗特, 圣埃芬妮·卡内塞奇, 奥利维尔·巴塞特, 塞德里克·西恩德拉莱维兹（Cédric Szyndralewiez）, 弗雷迪·海茨, 帕特里克·佩奇, 泽维尔·蒙特, 莉莲·米查利克, 杰克·阿比塞, Curzio Rüegg公司, 卡尔·海因茨·克劳斯, 击败A Imhof
附属公司

靶向血管NADPH氧化酶1通过PPARα介导机制阻断肿瘤血管生成

萨拉·加里多·乌尔巴尼等。 公共科学图书馆一号。 。

勘误表in

  • 公共科学图书馆一号。2011;6（2）.doi:10.1371/注释/a392bbef-b0ec-4c70-b403-74a 7bad85178。Imhof，Beat[更正为Imhof、Beat A]

摘要

活性氧（ROS）是内皮细胞迁移、增殖和存活的调节器，与血管生成密切相关。产生ROS的NOX酶的不同亚型在脉管系统中表达，并通过不同的定位和激活提供不同的信号提示。我们发现，NOX1缺乏的小鼠，而不是NOX2或NOX4，会损害血管生成。血管生成刺激后，NOX1在原代小鼠和人内皮细胞中的表达和活性增加。NOX1沉默通过抑制NF-κB调节因子PPARα减少内皮细胞迁移和管状结构的形成。使用新型NOX特异性抑制剂以PPARα依赖的方式减少体内血管生成和肿瘤生长。总之，血管NOX1是血管生成的关键介质，是抗血管生成治疗的一个有吸引力的靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：GKT136901正在申请专利，PP为发明人，GenKyoTex为专利所有人。PP、CS和K-HK持有GenKyoTex的股份。fulvene-5正在申请专利，JLA是发明者，埃默里大学是专利所有人。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

数字

图1
图1。NOX1缺乏小鼠表现出血管生成能力降低。
用500 ng/ml bFGF加载Matrigel，并将其植入NOX缺乏小鼠皮下。一周后，静脉注射碘化脂质体，并通过X射线断层扫描分析栓塞。（a） 基质凝胶栓塞血管化的量化。图中显示了灰色密度±s.e.m.的平均值。对于WT、NOX1 KO和NOX1/2 KO n=8，对于NOX2 KO与NOX4 KO n=6。（b）切除塞子的照片，比例尺代表（a）中实验塞子中的1 cm.c.血管密度。图表显示PECAM-1阳性面积的百分比±s.e.m.（d）。PECAM-1免疫染色照片，绿色为PECAM-1，蓝色为细胞核，比例尺代表20µm。使用20x/0.5数字孔径透镜获取图像，并使用LSM510 Meta共焦显微镜（卡尔蔡司）进行分析。e.容器尺寸分析；管腔小于20µm的血管被视为小血管（黑色），从20到50中等（深灰色），超过50µm为大血管（浅灰色）±标准偏差（s.e.m.Anova p<0.01）；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2
图2。血管生成刺激上调NOX1的表达和活性。
用20 ng/ml的VEGF或b-FGF刺激小鼠原代肺内皮细胞（MLEC，a）、HUVEC（b）和小鼠内皮瘤细胞系（c）3小时后，通过实时定量PCR检测NOX1的表达。NOX1 mRNA的数量被归一化为看家基因、小鼠细胞微管蛋白和人类细胞β2-微球蛋白的数量，±s.e.m，n=3。NOX1的活性通过使用MLEC（d，g）、HUVEC（e，h）和小鼠内皮瘤（f，i）上的DHE底物进行ROS测量来评估。VEGF和b-FGF刺激以NOX1依赖的方式上调ROS生成。g、 h，i.图表显示了在有或无VEGF或b-FGF的情况下刺激的内皮细胞中ROS水平的量化。g.MLEC WT（黑色条）、MLEC WT+GKT136901（灰色条）、MLEC NOX1KO（白色条）。h.未经处理的HUVEC（黑色条）或用10µM的GKT136901处理的HUVEC（灰色条）。i.未经处理的小鼠内皮瘤细胞系（黑条），用10µM（灰条）的GKT136901处理，用NOX1 siRNA处理（白条）。使用Student t检验，结果以倍数增加±s.e.m表示，n=3.*p<0.05，***<0.001。
图3
图3。GKT136901抑制NOX1依赖性ROS生成。
（a） 从NOX1过表达细胞制备的膜上GKT136901（）和DPI（x）的浓度响应曲线。结果代表了四分之一的实验，共进行了三次。数值表示为平均值±s.e.m.（b）GKT136901和DPI对NOX1、NOX2、NOX4和黄嘌呤氧化酶的亲和力。GKT136901是一种NADPH-氧化酶特异性抑制剂，对NOX1和NOX4的选择性高于NOX2，而DPI以相同的效力抑制所有测试的NADPH氧化酶。
图4
图4。NOX1抑制阻断内皮细胞迁移和管状结构的形成。
通过创伤愈合试验分析小鼠原代内皮细胞（a）、人原代内皮细胞核（b）和内皮瘤细胞系（c）的体外迁移。通过三维培养小鼠原代内皮细胞（d）、人原代血管内皮细胞（e）或内皮瘤细胞系（f）来测量管状结构的形成。使用Student t检验，结果以控制±s.e.m的%表示，n=3.*p<0.05，**p<0.01，***<0.001。GKT136901的使用浓度为10µM。
图5
图5。NOX1负调节PPARα的表达和活性。
NOX1缺乏导致PPAR上调α内皮细胞中促血管生成信号的表达和抑制。（a） ●●●●。PPAR表达水平α在MLEC和内皮瘤细胞系中通过定量实时PCR，归一化为微管蛋白表达。（b–c）PPARα拮抗剂GW6471补偿了MLEC中的NOX1缺乏。（b） ●●●●。存在或不存在PPAR时NOX1缺陷MLEC的迁移α拮抗剂（10µM）。（c） ●●●●。存在或不存在PPAR时NOX1缺陷MLEC的管状结构形成α拮抗剂（10µM）。在没有NOX1的情况下，VEGF和b-FGF诱导的NFκb核转位受到抑制，并且依赖于PPARα活动。（d） ●●●●。Western blot分析用VEGF和bFGF（20 ng/ml）刺激30分钟后WT和NOX1缺陷细胞的细胞核和细胞质部分的p65 NFκB。（e） ●●●●。在用VEGF和bFGF刺激之前，用Western blot分析经或不经10µM GW6471处理的NOX1-silenced细胞的细胞核和细胞质部分中的p65 NFkB。图中显示了通过密度测定法测定的细胞核p65 NF-κB相对于细胞质p65 NFκB±s.e.m的丰度。n=3.*p<0.05，**p<0.01（学生t检验）。
图6
图6。抑制NOX1可减少肿瘤生长和血管生成。
将B16F0（a）或LLC1（b）肿瘤细胞皮下注射到WT或NOX1-KO小鼠体内。允许肿瘤生长10天，通过测量阳性（血管）面积和总（肿瘤）面积±s.e.m（以百分比表示），用PECAM-1染色鉴定肿瘤血管密度。n=8；注射LLC1肿瘤细胞的WT小鼠口服NOX抑制剂GKT136901（40 mg/kg/天）8天；（c） ●●●●。图表以mg±s.e.m表示肿瘤重量，每组n=8。（d） ●●●●。（c）中实验得出的肿瘤血管密度。图中显示肿瘤血管化，以PECAM-1阳性面积±s.e.m.的百分比表示。；（e） ●●●●。肿瘤体积变化（单位：mm）三在肿瘤细胞注射GKT136901（黑箭头）或抗VEGFR2（DC101）（尖箭头）后8天开始治疗后。用卡尺测量肿瘤体积，公式V=4/3π（L/2*L/2*w/2）。n=8；（f） ●●●●。来自（e）中实验的肿瘤中的血管密度。第12天。图表显示肿瘤血管化以PECAM-1阳性面积±s.e.m.WT或PPAR的百分比表示α注射B16F0（g）或LLC1（h）的KO小鼠随后用NOX抑制剂GKT136901以40mg/kg/天通过口服给药处理8天。图表显示肿瘤血管化以PECAM-1阳性面积±s.e.m.的百分比表示，n=6.*p<0.05，**p<0.01（学生t检验）。
图7
图7。NOX1在肿瘤血管生成中的作用示意图。
（a） 肿瘤细胞和肿瘤浸润白细胞在肿瘤发展过程中产生促血管生成因子，如VEGF和bFGF。这些因素通过发芽、迁移和增殖激活原有血管形成新血管。（b） 内皮细胞通过将血管生成因子固定在表面受体上接受血管生成刺激。此交互启动信号级联，从而通过Rac1激活NOX1。NOX1依赖性ROS抑制核激素受体PPARα通过翻译后修饰和转录调控。这种抑制导致NF-κB活化和血管生成因子如基质金属蛋白酶、生长因子或迁移分子的转录。
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