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.2011年3月16日；30(6):1067-78.
doi:10.1038/emboj.2011.33。 Epub 2011年2月15日。

SUMO系统控制新型哺乳动物核糖体生物生成复合物的核仁分配

伊丽莎白·芬克贝纳 1, 马库斯·海德尔, 斯特凡·慕勒
附属公司

SUMO系统控制新型哺乳动物核糖体生物生成复合物的核仁分配

伊丽莎白·芬克贝纳等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

核糖体的生物发生是一个受到严格控制的途径，需要蛋白质网络的复杂时空相互作用。大多数结构rRNA成分在核仁中生成，并组装成前核糖体颗粒，这些颗粒被转移到核质和细胞质中进一步成熟。在后生动物中，这些过程的调节成分很少被描述出来。先前的工作揭示了SUMO特异性蛋白酶SENP3在核糖体生物生成的核仁步骤中的关键作用。我们用生化方法纯化了一种由PELP1、TEX10和WDR18组成的SENP3相关复合物，并证明该复合物参与大核糖体亚基的成熟和核仁释放。我们确定PELP1和PELP1-associated factor LAS1L为SUMO的SENP3敏感性靶点，并提供证据证明平衡的SUMO共轭/去共轭决定了该复合物的核仁分配。这将PELP1-TEX10-WDR18复合物定义为核糖体生物发生的调节器，并表明其SUMO控制的分布协调核糖体形成的速度。这些发现有助于对哺乳动物核糖体生物发生的基本理解，并为SUMO在这一过程中的作用提供了新的线索。

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数字

图1
图1
SENP3与PELP1、TEX10和WDR18关联。(A类,B)标记-SENP3或HA-PELP1在HeLa细胞中表达，如图所示。将蛋白质捕获在Flag或HA珠上，并使用针对内源性PELP1或SENP3的抗体进行免疫印迹。(C)用兔多克隆抗体从HeLa细胞中免疫沉淀出内源性PELP1，并用抗SENP3抗体的免疫印迹法检测免疫复合物中是否存在SENP3。(D类–F类)标记或HA-标记的蛋白质在HeLa细胞中表达，捕获在标记或HA-beads上，并按照指示进行免疫印迹。在所有实验中，输入占总细胞裂解物的2.5%。
图2
图2
WDR18和TEX10与PELP1共同免疫沉淀。(A类,B)如图所示，标记-PELP1和HA-WDR18在HeLa细胞中表达。HA-WDR18被捕获在HA-beads上，并通过免疫印迹法探测结合材料是否存在如图所示的外源性表达的标记PELP1或内源性PELP1。(C)用兔多克隆抗体从HeLa细胞中免疫沉淀内源性PELP1，并用抗WDR18抗体进行免疫印迹检测内源性WDR18的存在。(D类)用HA-PELP1在HeLa细胞中表达Flag-TEX10，并将其捕获在Flag-bads上，如图所示对蛋白质进行免疫印迹。(E类)表达HA-TEX10，捕获到HA-beads上，并用免疫印迹法检测相关蛋白是否存在内源性WDR18。输入值占总细胞裂解物的2.5%。(F类)PELP1、TEX10、WDR18和SENP3之间相互作用的方案。
图3
图3
PELP1定位于核仁的颗粒区域。(A类–C)HeLa细胞内源性PELP1、SENP3、UBF1和NPM1的免疫荧光染色。用DAPI染色观察细胞核。
图4
图4
PELP1、TEX10、WDR18和MDN1参与核糖体的生物生成。(A类)总结rRNA处理主要步骤的图表。(B)用靶向PELP1、TEX10、WDR18、MDN1或对照siRNA的siRNA双工体转染HeLa细胞。如图所示（WB，三个下部面板），通过western blotting分析各蛋白的下调。转染72小时后，用脉冲标记细胞32对正磷酸作用1 h并追踪2.5 h。RNA在变性琼脂糖凝胶上分离，并在凝胶干燥后通过溴化乙锭（EtBr）染色和放射自显影术检测。(C)通过磷光成像仪分析量化28S和32S rRNA形式的信号强度，并计算28S:32S rRNA的比率。值表示四个独立实验的平均值（siMDN1为两个）。误差线表示s.d(D类)PELP1与含ITS2的RNA物种相关。从HeLa细胞中免疫沉淀内源性PELP1。总的来说，10%的免疫沉淀物质通过western blotting进行分析（下表）。剩余的材料用于RNA分离和cDNA合成。将该cDNA作为模板，使用ITS2/28S区域内的引物或GAPDH作为对照进行PCR扩增。输入相当于细胞裂解液的10%。上部面板中的垂直线表示删除了不相关的相邻车道。(E类)通过核提取物的蔗糖梯度离心分离核糖体前颗粒。通过TCA沉淀法从组分中回收蛋白质，并使用所示抗体通过SDS-PAGE和western blotting进行进一步分析。垂直线仅表示加载到两个单独的凝胶上。(F类)在PELP1、TEX10、WDR18、MDN1或SENP3缺失的细胞中，60S前粒子的核仁输出受到严重影响。从四环素诱导的启动子中表达YFP-RpL27的HeLa细胞被所示的siRNA转染。24小时后，诱导YFP-RpL27表达，72小时后监测RpL27的定位。照片是用相同的曝光时间拍摄的。
图5
图5
PELP1由SUMO在SENP3控制过程中进行修改。(A类)在HeLa细胞中存在或不存在SV5标记的SENP3的情况下，HA-PELP1单独或与SUMO1或SUMO2联合表达。通过western blotting验证各蛋白的表达。检测β-微管蛋白作为负荷控制。(B)如图所示，在转染siRNAs的HeLa细胞中，通过抗PELP1免疫印迹监测内源性PELP1的SUMO修饰。通过western blotting证实了各个蛋白质的耗竭。(C)如图所示，用siRNAs和质粒转染HeLa细胞。在Ni-NTA珠上回收His-SUMO结合物，并使用抗PELP1抗体进行免疫印迹。(D类)HA-PELP1或HA-PELPK826R公司在HeLa细胞中存在SUMO1或SUMO2时表达。通过western blotting分析各蛋白的表达。检测β-微管蛋白作为负荷控制。(E类,F类)标记-p14农业研究基金和SUMO在HeLa细胞中表达，并用所示的抗HA或抗PELP1抗体免疫印迹监测外源表达的HA-PELP1或内源性PELP1的SUMO修饰。箭头表示SUMO–PELP1共轭。
图6
图6
PELP1的核仁分配由SUMO系统控制。(A类)瞬时转染HeLa细胞表达Flag-SUMO2。通过间接免疫荧光法观察到标记SUMO2表达细胞。使用抗PELP1抗体在Flag-SUMO2-阳性细胞（绿色箭头）或未转染细胞（白色箭头）中监测内源性PELP1的定位。(B–D类)如图所示，用siRNA转染HeLa细胞。固定和渗透后，使用相应的抗体通过间接免疫荧光监测PELP1、LAS1L、TEX10或PES1的定位。(E类)HeLa细胞被耗尽内源性PELP1，并用表达野生型HA标记的PELP1或Flag标记的PELP1–SUMO2融合蛋白的siRNA抗性构建体重建。使用抗HA或抗Flag抗体通过间接免疫荧光监测各自蛋白的定位。(F类)在表达Flag-PELP1-SUMO2的细胞中分析LAS1L或SENP3的定位。使用抗LAS1L或抗SENP3抗体进行间接免疫荧光。用DAPI对细胞核进行复染。
图7
图7
LAS1L由SUMO以SENP3控制方式进行修改。(A类)LAS1L由生成在体外转录/翻译，分别与重组E1和E2酶以及SUMO1或SUMO2在ATP存在下孵育。在控制反应（车道1）中，未添加SUMO。(B)如图所示，用siRNAs和质粒转染HeLa细胞。通过western blotting验证各蛋白的表达。检测β-微管蛋白作为负荷控制。(C)如图所示，用siRNAs和质粒转染HeLa细胞。将His-SUMO2结合物捕获在磁性Ni-NTA微球上，并使用抗LAS1L抗体进行免疫印迹。垂直线表示从初始凝胶中去除不相关的相邻通道（参见补充图14）。
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