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.2011年7月；4(4):469-83.
doi:10.1242/dmm.006510。 Epub 2011年2月14日。

实验性心肌梗死触发典型Wnt信号转导和内皮-间充质转化

Omonigho Aisagbonhi 1, Meena Rai公司, 谢尔盖·里佐夫, 尼克·阿特里亚, 伊戈尔·费奥基斯蒂索夫, 安东尼斯·哈佐普洛斯
附属机构

实验性心肌梗死触发典型Wnt信号转导和内皮-间充质转化

Omonigho Aisagbonhi等人。 Dis模型机械. 2011年7月.

摘要

尽管有可用的治疗方法，心肌梗死（MI）仍是世界范围内的主要死亡原因。更好地了解调节心脏修复的分子和细胞机制应有助于改善心肌梗死患者的临床结局。使用报告小鼠系TOPGAL，我们显示实验性心肌梗死后4天，心外膜下内皮细胞和血管周围平滑肌肌动蛋白（SMA）阳性（SMA（+））细胞中诱导典型（β-catenin-dependent）Wnt信号。缺血性损伤后1周，在肉芽组织形成过程中，梗死区聚集了大量典型的Wnt阳性细胞。与典型Wnt激活相一致，心肌梗死后也触发了内皮-间充质转化（EndMT）。通过细胞谱系追踪，我们发现典型Wnt标记的SMA（+）间充质细胞的很大一部分来源于内皮细胞。典型Wnt信号在培养的内皮细胞中诱导间充质特性，表明其在EndMT中起直接作用。总之，我们的研究表明，典型Wnt激活和EndMT是心肌梗死的分子和细胞反应，典型Wnt信号传导活性是参与心肌梗死后心脏组织修复的EndMT衍生间充质细胞的特征性特性。这些发现可能导致新的策略，通过对典型Wnt信号的时间和细胞类型特异性操作来改善心脏修复过程。

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图1。
图1。
MI后Wnt和Dkk家族成员的诱导。（A） 在永久性LAD闭塞或假手术后5天（5d），对C57BL/6J小鼠心脏分离的mRNA进行RT-PCR分析，以检测Wnt通路介质的表达。显示了三只具有代表性的独立对照和MI小鼠的结果（来自六个样本）。（B） 通过实时定量RT-PCR进行定量。使用Student’s吨-测试：*P（P）<0.05;***P（P）<0.001; NS，不显著。对照组假手术，n个=6; MI样本，n个=6.
图2。
图2。
正常成年小鼠心脏典型Wnt信号活动。使用TOPGAL小鼠系对成人心脏典型Wnt活性进行整体和组织学分析。（A） X-gal染色的整体心脏显示心脏底部大血管中典型的Wnt活性。该区域的组织切片显示主动脉中膜和内膜（左中图）、肺动脉（右中图）和冠状动脉以及心外膜下微血管（右）的典型Wnt活性。（B） 部分切割心脏的全贴X-半乳糖基化染色显示心脏瓣膜中具有典型Wnt活性的细胞（左）。组织切片（两个右侧面板）显示流出道（主动脉）和房室（二尖瓣）瓣膜结缔组织中典型Wnt活性阳性的细胞。（C） 来自TOPGAL小鼠主动脉的X-gal染色切片上的抗CD31抗体染色（棕色）显示血管内皮细胞中的典型Wnt活性（箭头）。（D） X-染色主动脉切片上的抗-SMA抗体结合（棕色）表明血管周围SMA中典型的Wnt活性（蓝色）+细胞。右三个面板是组织切片的IF图像，用识别血管平滑肌细胞（绿色）和β-半乳糖苷酶（红色）中SMA的抗体染色。合并后的图像（最右侧）显示两种抗原在主动脉内膜和中层细胞中的共定位。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。
图3。
图3。
实验性心肌梗死后典型Wnt信号通路的激活。通过永久性结扎LAD诱导TOPGAL小鼠心肌梗死。假手术动物接受了相同的手术程序，没有进行血管结扎。（A） 缺血性损伤反应的实验时间线和相应阶段的示意图。（B） 在心肌梗死后24小时、4天、7天和3周分离心脏，并用X-gal染色以评估标准Wnt活性。上面板：带有可见缝线的前视图；中间面板：后视图；下面板：感兴趣区域和梗死部位的高分辨率图像。在假手术对照心脏中，β-半乳糖苷酶活性染色在手术后的所有时间点都无法与正常（即非手术）心脏区分，大血管周围有典型的Wnt活性。显示的假样本来自手术后7天。同样，与非手术心脏相比，LAD闭塞24小时后β-半乳糖苷酶染色也没有明显变化。相比之下，从心肌梗死后第4天开始，大量X-gal阳性细胞（箭头）出现在心脏血管周围。心肌梗死后7天，梗死区和梗死周围区域出现典型Wnt活性的X-gal阳性细胞（箭头所示）。β-半乳糖苷酶（典型Wnt途径）活性在实验性心肌梗死后3周的损伤区域内未检测到。（C）在LAD闭塞后的指定时间点，使用从小鼠心脏分离的RNA进行实时定量RT-PCR分析。在手术后相同时间点分离的假手术动物的RNA样本作为对照。Sham样本在损伤后的所有阶段都有相似的表达水平。在心肌梗死样本中，典型Wnt信号传导的假定靶基因的峰值表达水平与心肌梗死后第7天β-半乳糖苷酶活性最高的时间一致，除了Myc公司早期（24小时）诱导。*对<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.001; NS：不显著。伪装，n个=6; 心肌梗死后24小时，n个=3; MI后7天，n个=6；心肌梗死后3周，n个=3.
图4。
图4。
典型Wnt活性标志着心肌梗死后内皮细胞和肌成纤维细胞。LAD闭塞或假手术后7天，对TOPGAL小鼠心脏进行典型Wnt活性的组织学分析。（A） X-gal染色小鼠心脏的组织切片显示，在假心脏组织中，β-半乳糖苷酶（典型Wnt信号传导）的活性仅限于冠状血管的内皮细胞和周细胞以及微血管内皮细胞中（左图）。心肌梗死后，除了冠状血管和微血管外，典型Wnt信号标志着梗死区周围新出现的心外膜下间质样细胞和心外膜细胞亚群（中间两个面板）。相比之下，在心内膜下区域（右图）不存在典型Wnt信号传导活跃的细胞。（B） TOPGAL小鼠心脏组织切片的免疫组织学分析。在X-染色的心脏组织上使用抗CD31抗体的IHC显示近红外区内皮细胞（棕色）的典型Wnt活性（蓝色）（白色箭头）。右侧三个面板显示了使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和-CD31（红色）抗体获得的IF结果，以及相应的合并图像。典型Wnt活性标记内皮细胞（白色箭头）。显示了无典型Wnt活性的内皮细胞（红色箭头）和非内皮、典型Wnt横向活性细胞（绿色箭头）的示例。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。（C） 使用TOPGAL小鼠X-gal染色心肌组织切片上的抗SMA抗体进行IHC分析，显示SMA中典型的Wnt活性（蓝色）+近红外区的细胞（棕色）（白色箭头）。右侧三个面板显示了使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和-SMA（红色）抗体获得的IF结果，以及相应的合并图像。蓝色是核DAPI复染。标准Wnt活动标志SMA+单元格（白色箭头）。绿色箭头指向SMA——具有典型Wnt通路活性和SMA红色箭头的细胞+缺乏典型Wnt活性的细胞。SMA的一部分——具有典型Wnt途径活性的细胞是巨噬细胞（补充材料图S1）。（D） 通过计算每个视野中双X-gal/CD31染色和单个CD31阳性细胞的数量，对典型的Wnt-活性标记内皮细胞进行量化。标准Wnt-active SMA+细胞数量通过计算SMA表达的X-gal阳性细胞数量在给定视野中占总细胞数的百分比或占总SMA的百分比进行量化+细胞数量。*P（P）<0.05;***P（P）<0.001. 对照组假手术，n个=5; MI样品，n个=5.
图5。
图5。
心肌梗死后诱发终末MT。（A） 用识别心肌梗死后7天分离的小鼠心脏切片上CD31（红色）和SMA（绿色）的抗体进行IF分析。下面板是装箱区域的放大倍数较高。右侧相应的合并图像显示CD31和SMA共存的细胞（箭头）。DAPI用于细胞核（蓝色）的反染。（B） 使用MI或假手术后7天从梗死周围组织分离的细胞进行抗CD31和-SMA抗体的FACS分析。心肌梗死后第7天CD31和SMA双阳性细胞的数量显著增加（红圈）。完整的FACS数据集包含在补充材料图S2中。（C） FACS分析样本中CD31和SMA双阳性细胞的定量***P（P）<0.001. 对照组假手术，n个=3; MI后7天，n个=3.（D）如图所示，使用在MI后特定阶段分离的TOPGAL小鼠心脏的RNA样本，实时定量RT-PCR分析上皮-间充质转化（EMT）或终末MT相关基因的表达。推测EMT-和/或EndMT相关基因的峰值表达水平发生在MI后7天肉芽组织形成期间***P（P）<0.001; NS：不显著。对照组假手术，n个=6; MI后24小时，n个=3; 7天，n个=6; 3周，n个=3.（E）使用抗β-半乳糖苷酶（绿色）和蜗牛（红色）抗体对TOPGAL小鼠心脏切片进行IF分析。DAPI用于核复染（蓝色）。右侧面板是合并图像中方框区域的较高放大倍数。合并的图像显示，典型的Wnt-signaling活性细胞也表达EMT调节蛋白蜗牛（橙色；箭头）。
图6。
图6。
标准Wnt-signaling-marked SMA+ 细胞来源于内皮细胞。End-SCL-lacZ双转基因小鼠每隔一天用三苯氧胺治疗10天，以诱导Cre-ERT型重组酶和基因标记内皮细胞及其后代。在最后一次给药他莫昔芬后7天，对小鼠进行LAD闭塞或假手术。（A） 冠状动脉结扎或假手术后7天的X-半乳糖染色和组织学分析。在假手术小鼠中，Cre重组酶的诱导仅标记心外膜下区域的内皮细胞（上面板；箭头）。相比之下，在心肌梗死后第7天的组织切片中，β-半乳糖苷酶活性标记了内皮细胞和间充质样细胞（箭头所示），表明后者起源于内皮细胞（下图）。（B） 在心梗后7天，用抗SMA抗体在tamoxifen治疗的终末期SCL-lacZ小鼠的X-gal染色心肌组织切片上进行IHC分析。心肌梗死样品心外膜下近端区域观察到双β-半乳糖苷酶/SMA阳性细胞，而假对照组则没有，这表明SMA+细胞来源于内皮细胞。左下角的面板显示了放大倍数较高的方框区域。箭头表示SMA/β-半乳糖苷酶双阳性细胞。该图量化了典型Wnt活性和SMA双阳性细胞占总SMA的百分比+心外膜下组织中的细胞***P（P）<0.001;n个=14个视野。（C） 使用抗β-catenin抗体对三苯氧胺治疗的终末期SCL-lacZ小鼠心肌梗死后7天的X-gal染色心肌组织切片进行IHC分析。左侧面板：假对照显示β-catentin在心肌细胞（白色箭头）和内皮细胞亚群（白色箭头所示）的夹层盘中积聚。中间和右侧面板：心肌梗死后7天，间充质细胞中也存在核β-catenin（黑色箭头）。黑色箭头表示心肌细胞间盘中的β-连环蛋白染色。右侧面板显示了中间图像中方框区域的放大倍数。
图7。
图7。
典型Wnt信号的激活导致培养内皮细胞中的间充质转化。用典型Wnt信号激活剂BIO处理成年BAEC和小鼠脑bEnd.3内皮细胞系，研究典型Wnt信息激活的影响。（A）BIO在处理24小时内诱导BAEC的间充质表型。（B） 使用生物处理BAEC的RNA样本进行实时定量RT-PCR分析。BIO诱导典型Wnt信号基因靶点的表达(轴2,TCF7公司)和EndMT相关基因(鼻塞,座椅模块组件,第1A1列)而它导致内皮特异性基因的下调CD31型.规范性靶基因的诱导(轴2,TCF7公司)和下调CD31型发生在BIO治疗的24小时内，而诱导座椅模块组件和第1A1列直到接触BIO 3天后才观察到。（C）用BIO（+）或其非活性类似物MeBIO（-）处理48小时的bEnd.3细胞的IF分析，并用识别CD31（绿色）和SMA（红色）的抗体染色。BIO处理导致CD31下调和SMA上调，这与BAEC中获得的分子数据一致。（D） 用BIO（+）或MeBIO（-）处理1、4或24小时，并用识别β-连环蛋白的抗体（红色）染色的bEnd.3细胞的IF分析。BIO治疗导致β-catenin的核积累，这是典型Wnt信号激活的标志。DAPI染色（蓝色）标记细胞核。所有BIO治疗时间点（1、4或24小时）均显示核β-catenin（箭头）。这些图像来自4小时曝光。（E） 利用瞬时转染Super TOPFlash和pRL-TK的bEnd.3细胞分离的蛋白提取物进行荧光素酶分析雷尼利亚荧光素酶报告器用于正常化。bEnd.用BIO、MeBIO或载体（DMSO）处理3个细胞6小时。BIO的添加增加了荧光素酶的活性，表明典型Wnt通路的诱导。
图8。
图8。
心肌梗死后心脏修复细胞生成的示意图模型。典型Wnt信号标志着内皮细胞正在经历间充质转化（蓝色），产生一种迁移的间充质细胞类型，该类型同时表达内皮细胞(CD31型)和间充质(座椅模块组件)标记物处于低水平。间充质中间细胞类型也以典型Wnt信号为标志，具有双重潜能，可分化为内皮细胞和新血管，或产生瘢痕组织生成的肌成纤维细胞。
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