Hypoxia-inducible factor 1 mediates increased expression of NADPH oxidase-2 in response to intermittent hypoxia

doi:10.1002/jcp.22640

.2011年11月；226(11):2925-33.

doi:10.1002/jcp.22640。

低氧诱导因子1介导NADPH氧化酶-2在间歇性低氧反应中的表达增加

袁国祥¹, 沙基尔·阿汗, 罗微, 贾亚斯里·南杜里, 格雷格·塞门扎, Nanduri R Prabhakar公司

附属公司

PMID： 21302291
预防性维修识别码：项目经理4695992
内政部： 10.1002/jcp.22640

低氧诱导因子1介导NADPH氧化酶-2在间歇性低氧反应中的表达增加

袁国祥等。 J细胞生理学. 2011年11月.

.2011年11月；226(11):2925-33.

doi:10.1002/jcp.22640。

作者

袁国祥¹, 沙基尔·阿汗, 罗微, 贾亚斯里·南杜里, 格雷格·塞门扎, Nanduri R Prabhakar公司

附属

¹美国伊利诺伊州芝加哥大学生物科学部集成生理学研究所和氧气传感系统生物学中心，邮编：60637。

PMID： 21302291
预防性维修识别码：项目经理4695992
内政部： 10.1002/jcp.22640

摘要

睡眠呼吸紊乱伴反复呼吸暂停与间歇性缺氧（IH）相关。IH引起的心血管疾病是由前氧化酶，特别是NADPH氧化酶-2（Nox2）产生的活性氧（ROS）增加引起的。先前的研究表明：（i）IH以ROS依赖的方式激活低氧诱导因子1（HIF-1），（ii）HIF-1是IH诱导ROS生成所必需的，这表明存在前馈机制。在本研究中，我们使用多种药理学和遗传学方法，研究了HIF-1是否介导IH诱导的Nox2表达在小鼠中枢和外周神经系统以及培养细胞中。IH增加PC12嗜铬细胞瘤细胞以及野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的Nox2 mRNA、蛋白质和酶活性。通过RNA干扰或药物抑制（地高辛或YC-1）阻断HIF-1活性或通过MEF中HIF-1α的基因敲除来消除或减弱这种作用。通过用铁螯合剂去铁胺处理PC12细胞20小时或用HIF-1α表达载体转染它们来增加HIF-1α的表达，增加了Nox2的表达和酶活性。野生型小鼠暴露于IH（8小时/天，持续10天）后，大脑皮层、脑干和颈动脉体中的Nox2 mRNA表达上调，但小脑中没有上调。IH未在Hif1a（+/-）小鼠的皮层、脑干、颈动脉体或小脑中诱导Nox2表达，这些小鼠对IH的反应没有表现出ROS增加或心血管疾病。这些结果建立了HIF-1、ROS生成和心血管病理学对IH反应的致病机制。

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数字

图1
IH上调PC12细胞中的Nox2。A： Nox2 mRNA表达分析。细胞暴露于20%O₂（N）或10–60次IH循环（1.5%O下30秒₂在20%O下交替5分钟₂). 实时反转录PCR检测Nox2 mRNA与18的比值*S公司*rRNA。结果被归一化为正常氧细胞的结果。B： Nox2蛋白表达。对暴露于0-60周期IH的细胞裂解物进行Western blot分析。*顶部零件*，代表性Nox2免疫印迹。*底部零件*，将Nox2蛋白的密度分析标准化为微管蛋白表达，并表示为与常氧对照的百分比变化（N）。C：氮氧化物酶活性分析。如材料和方法中所述，对暴露于0-60个IH循环的细胞的膜组分中的Nox活性进行分析。在IH暴露前向细胞中添加的落叶松素（500µM）和AEBSF（300µM₆₀-暴露的细胞。D： Nox2 siRNA防止IH₆₀-诱导Nox2蛋白上调。用Nox2或干扰siRNA转染细胞，然后暴露于IH₆₀.顶部零件、代表性Nox2和微管蛋白（对照蛋白）免疫印迹分析。*底部零件*Nox2蛋白的密度分析归一化为微管蛋白表达，并表示为常氧对照的百分比（N）。E： IH对siRNA-转染PC12细胞中Nox酶活性的影响₆₀显示平均值±SEM（n=3–5）***P（P）*与对照组相比<0.01（N）。

图2
地高辛阻断IH对HIF-1的激活和Nox2的上调。A：地高辛抑制IH₆₀-以浓度依赖性方式诱发HIF-1α积聚。*顶部零件*，代表性HIF-1α免疫印迹。*底部零件*HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与常氧对照组相比的百分比变化（N）。B：地高辛通过IH抑制HIF-1依赖性报告基因的表达。将含有SV40启动子和荧光素酶编码序列上游HRE的p2.1和含有RSV启动子和β-gal编码序列的pRSV-LacZ与PC12细胞共转染。将转染的细胞暴露于20%O₂（N）或120次IH循环（IH 120）。C、 D：地高辛抑制对IH反应中Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）的上调。显示平均值±SEM（n=3-5）***P（P）*与对照组相比<0.01（N）。

图3
YC-1抑制接触IH的PC12细胞中HIF-1激活和Nox2上调。A： YC-1区块IH₆₀-以浓度依赖性方式诱发HIF-1α积聚。*顶部零件*，代表性HIF-1α免疫印迹。*底部零件*HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与常氧对照组相比的百分比变化（N）。B： YC-1抑制HIF-1依赖性报告基因表达以应对IH。C、 D:YC-1阻断IH上调Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）。显示平均值±SEM（n=3-5）***P（P）*与对照组相比<0.01（N）。

图4
siRNA沉默HIF-1α可消除IH暴露细胞中的Nox2上调。A–C：转染HIF-1αsiRNA的IH暴露PC12细胞中没有HIF-1βmRNA上调（A）、蛋白积累（B）和HRE报告基因表达（C）。细胞转染HIFα或对照扰民（Scr）siRNA，然后暴露于IH。*上部零件*在B中，HIF-1α和微管蛋白免疫印迹的代表性示例。下部在B中，HIF-1α蛋白的密度分析标准化为微管蛋白表达，并分别以常氧对照的百分比表示。D、 E:IH公司₆₀-在用HIF-1α转染的细胞中，诱导的Nox2 mRNA表达上调（D）和Nox2活性上调（E）显著减弱，但用Scr、siRNA转染的细胞没有减弱。显示了平均值±SEM（n=5）***P（P）*与对照组相比<0.01（N）。

图5
暴露于IH的HIF-1α缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中无Nox2激活。A： IH激活HRE报告基因表达₁₂₀在野生型（WT）MEF中，HIF-1α基因敲除（KO）MEFs中没有这种反应。B–D：无IH₆₀-诱导KO MEF中Nox2 mRNA（B）和蛋白（C）表达及酶活性（D）上调。显示平均值±SEM（n=5）***P（P）*< 0.01; #*P（P）*< 0.05; 和N.S.，不显著(*P（P）*>0.05）。

图6
HIF-1α过度表达增加Nox2的表达和活性。A：去甲氧胺（1mM；DFO）处理20小时可增加PC12细胞中HIF-1α的积累。*顶部零件*，代表性HIF-1α免疫印迹。*底部零件*HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与对照组相比的百分比变化（C）。B–D:DFO增加HIF-1依赖性基因表达（B）Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）。E：用1µg碱性载体（pBS）或HIF-1α质粒（HA）转染PC12细胞_三-HIF-1α）。*顶部零件*，代表性HIF-1α免疫印迹。*底部零件*HIF-1α蛋白水平归一化为微管蛋白水平的密度分析。F–H：HIF-1α过度表达增加HIF-1依赖基因表达（F）、Nox2 mRNA表达（G）和Nox酶活性（H）。显示平均值±SEM（n=4）***P（P）*与对照组（C）或pBS相比<0.01。

图7
IH对大鼠中枢神经系统和颈动脉体中Nox2表达的影响*Hif1型*α^+/+野生型（WT）和*Hif1型*α^+/−杂合敲除小鼠。A–C：年龄和性别匹配的WT小鼠暴露于常氧（N）或IH（8小时/天×10天），并同时给予溶媒（IH）Origoxin（IH+D；1毫克/千克/天IP）和同窝鼠*Hif1型*α^+/−小鼠暴露于Nor IH。分析大脑皮层、脑干和小脑中的Nox2 mRNA（A）、HIF-1α和Nox2蛋白（B）以及Nox酶活性（C）。在相同的小鼠中测定颈动脉体中的Nox2 mRNA水平（A）。显示平均值±SEM（每组5只小鼠）***P（P）*<0.01和N.S.，不显著(*P（P）*>0.05）。

图8
IH对小鼠大脑皮层、脑干和小脑中磷酸化PLCγ、PKC和mTOR水平的影响。成年雄性BALB/c小鼠暴露于常氧（N）或IH（8小时/天×10天）。通过对大脑皮层、脑干和小脑的组织裂解物进行免疫印迹分析，测定磷酸-PLCγ（p-PLCγ）、总PLCγ（PLCγ），磷酸-PKC（p-PKC）、总PKC（PKC），磷酸化mTOR（p-mTOR）和总mTOR的水平。

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1. Bedard K，Krause KH。ROS生成NADPH氧化酶的NOX家族：生理学和病理生理学。《生理学评论》，2007年；87:245–313.-公共医学
1. Chan SY，Zhang YY，Hemann C，Mahoney CE，Zweier JL，Loscalzo J.MicroRNA-210通过抑制铁硫簇组装蛋白ISCU1/2来控制缺氧期间的线粒体代谢。单元格元数据。2009;10:273–284.-项目管理咨询公司-公共医学
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