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DICER1缺陷诱导年龄相关性黄斑变性中Alu-RNA毒性

Hiroki Kaneko先生等人。 自然. .

摘要

地理萎缩（GA）是一种无法治疗的老年性黄斑变性的晚期形式，由视网膜色素上皮（RPE）细胞变性引起。在这里，我们表明，在GA患者的RPE中，microRNA（miRNA）处理酶DICER1减少，并且DICER1的条件消融，而不是其他七种miRNA处理酶，导致小鼠RPE退化。DICER1敲除诱导人RPE细胞中Alu RNA的积累和小鼠RPE中Alu样B1和B2 RNA的积累。患有GA的人类RPE中Alu RNA增加，这种致病性RNA在小鼠中诱导人类RPE细胞毒性和RPE变性。靶向Alu/B1/B2 RNA的反义寡核苷酸可防止DICER1耗竭诱导的RPE退化，尽管全球miRNA下调。DICER1降解Alu RNA，而这种消化的Alu RNA不能诱导小鼠RPE变性。这些发现揭示了DICER1的miRNA-依赖性细胞生存功能，包括逆转录转座子转录物降解，表明Alu RNA可以直接引起人类病理，并确定了主要致盲原因的新靶点。

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数字

图1
图1。DICER1标准GA缺陷导致RPE变性
一,DICER1标准与对照组RPE（n=11）相比，GA组人眼RPE含量较少（n=10）。对=0.004，通过Mann-Whitney U检验。DROSHA，DGCR8公司、和EIF2C2系统（编码AGO2）丰度无显著差异(对>0.11（通过Mann-Whitney U试验）。n=10–11。b条通过Western blotting（补充图1）评估DICER1定量，与对照组RPE（n=4）相比，人类GA RPE（n=4）中的DICER1定量更低。对=0.003，通过学生t检验。c（c），与对照眼相比，人类GA RPE的DICER1（蓝色）降低。d、 e（电子）、眼底照片(d日)和甲苯胺蓝染色切片(e（电子）)显示RPE变性最佳1Cre；骰子1飞行/飞行小鼠而非对照组。箭头指向RPE的基面。（f），扁平支架染色显示闭塞小带-1（ZO-1；红色）的RPE中断最佳1Cre；Dicer公司飞行/飞行小鼠与对照组比较。g、 小时、眼底照片(克)甲苯胺蓝染色切片(小时)显示RPE(g、 小时)和感光器(小时)退化骰子1飞行/飞行视网膜下注射AAV1的小鼠-最佳1-Cre但不是AAV1-最佳1-GFP。我，平板显示骰子1飞行/飞行视网膜下注射AAV1后小鼠RPE变性-最佳1-Cre但不是AAV1-最佳1-GFP。细胞核用Hoechst 33342染色为蓝色。显示了具有代表性的图像。n=16–32(d–f日); 10–12 (g–i类). 比例尺(c、 e、h)，10µm；(f、 我)20微米。j个，编码Cre重组酶（Ad-Cre）治疗的腺病毒载体减少骰子1飞行/飞行与Ad-Null或未处理（无Tx）细胞相比，小鼠RPE细胞的存活率。k个与对照反义（Ctrl-as）处理的细胞相比，DICER1反义（as）降低了人RPE细胞的活性。n=6–8。所有误差条均表示平均值±标准误差。
图2
图2。铝GA中的RNA积累由DICER公司减少
a、 b条，RPE中dsRNA免疫定位（蓝色）(a、 b条)和次RPE矿床（drusen；b条)在人类GA中。c、 d日，GA RPE中无同种抗体染色(c（c）)对照眼中含有抗dsRNA抗体(d日). 比例尺(a–d)，10µm。n=10(a–d)e（电子），免疫沉淀dsRNA的PCR扩增产生与铝在GA RPE中，但不是正常RPE。水分控制（−）未显示扩增，重组dsRNA（+）显示预测的扩增子。（f），增加了铝与对照组相比，GA RPE中的RNA（n=7）。对经Student t检验<0.05。在以下方面无显著差异铝神经视网膜中的RNA。正常眼睛的数值标准化为丰度。
图3
图3。DICER1标准降级铝核糖核酸
一，DICER1反义（as）增加铝人类RPE细胞中的RNA。b、 c，Ad-Cre，但不是Ad-GFP，增加了骰子1飞行/飞行小鼠RPE细胞核细胞(b条)和细胞质(c（c）).d日，DICER1上调铝人类RPE细胞核（Nuc）和细胞质（Cyt）中的RNA。e（电子），琼脂糖凝胶电泳显示重组DICER1（+）降解，而非热变性DICER1铝从人GA RPE中分离和克隆的RNA。6个实验的图像代表。（f）,铝人RPE细胞中RNA被质粒编码上调铝（pAlu）与pNull或24小时无治疗（无Tx）相比pDICER1降低*对< 0.05. n=4–8(a–d，f). 标准化值以控制处理后的值（用于铝)或Ad-GFP感染的细胞（用于B元素）。
图4
图4。DICER1标准保护RPE细胞免受铝RNA细胞毒性
一，视网膜下pAlu，但不为pNull，诱导野生型小鼠RPE变性（眼底照片，顶行；ZO-1染色（红色）平板，底行）。b条,铝RNA诱导的人类RPE细胞毒性。值标准化为pNull或vehicle*对经Student t检验<0.05。n=4-6。c（c），视网膜下铝从人GA-RPE中分离和克隆的RNA诱导野生型小鼠RPE变性。d日，视网膜下注射铝与假叶鼠相比，用DICER1切割RNA时，未诱导野生型小鼠RPE变性（眼底照片，顶行；平板，底行）铝RNA。蓝色箭头勾勒的退化(a、 c、d). 比例尺（20µm）。n=10-15。
图5
图5。DICER1标准动态调节通过以下途径诱导RPE细胞死亡铝RNA积累
一，由DICER1诱导的人RPE细胞毒性，由铝RNA as。数值标准化或与对照（Ctrl）as进行比较。b条，Ad-Cre但非Ad-Null诱导骰子1飞行/飞行小鼠RPE细胞毒性。B1/B2 RNA作为，而非对照（Ctrl）作为，挽救了生存能力。标准化为未处理细胞的值（无Tx）*对经Student t检验<0.05。n=4–6(a、 b条).c（c），视网膜下AAV-最佳1-Cre诱导的RPE变性（眼底照片中的蓝色箭头，顶行；ZO-1染色（红色）扁平支架，底行）骰子1飞行/飞行注射后20天，AAV后10天，视网膜下胆固醇结合B1/B2 as抑制小鼠，但胆固醇结合Ctrl as不抑制小鼠-最佳1-Cre注射。值规范化为Ctrl作为处理。n=8。比例尺，20µm。d日与Ctrl as相比，DICER1 as在人类RPE细胞中诱导了全局miRNA表达缺陷铝as和Ctrl as处理的DICER1耗尽细胞。n=3。
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中的注释

  • 愿景：Dicer跃入视野。
    梅斯特G。 梅斯特G。 自然。2011年3月17日；471(7338):308-9. doi:10.1038/471308a。 自然。2011 PMID：21412326 没有可用的摘要。

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