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比较研究
.2011年5月；140(5):1642-52.
doi:10.1053/j.gastro.2011.01.040。 Epub 2011年1月26日。

组织转谷氨酰胺酶不影响小鼠纤维化基质的稳定性或肝纤维化的消退

尤里·波波夫 1, 迪安娜·斯维尔德洛夫, 阿尼莎·沙尔玛, K Ramakrishnan Bhaskar公司, 李少勇, 托比亚斯·弗雷塔格, 詹姆斯·李, 沃尔伯加·迪特里希, 格里·梅利诺, Detlef Schuppan酒店
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比较研究

组织转谷氨酰胺酶不影响小鼠纤维化基质的稳定性或肝纤维化的消退

尤里·波波夫等。 胃肠病学. 2011年5月.

摘要

背景和目标：尽管缺乏功能性证据，但普遍存在的交联酶组织转谷氨酰胺酶（TG2）与肝纤维化中的不可逆胶原稳定有关。我们研究了TG2对肝纤维化基质稳定性的贡献，以及TG2缺乏小鼠肝纤维化的进展和消退。

方法：用四氯化碳或硫代乙酰胺诱导TG2（-/-）小鼠及其野生型同窝小鼠发生晚期肝纤维化，以研究长达36周的纤维化进展及其自发消退。通过组织学和肝羟脯氨酸定量分析纤维化的模式和程度。通过逐步提取胶原蛋白来评估肝脏基质交联的动态变化。用定量逆转录聚合酶链反应检测7个TGs和纤维素酶相关基因的表达。

结果：转谷氨酰胺酶活性在纤维化中增加，TG2信使RNA水平与纤维化相关基因的表达相关。生化分析显示胶原蛋白逐渐稳定，高度交联的胃蛋白酶不溶部分（26%）增加了6倍。在TG2（-/-）小鼠中，肝脏TG活性显著降低，但长期服用四氯化碳或硫代乙酰胺导致肝纤维化的程度和模式与野生型小鼠相当。在TG2（-/-）小鼠中，肝胶原组分的组成和纤维化相关转录物的水平没有改变，也没有促进纤维化逆转。

结论：TG2和TG活性在肝纤维化进展过程中上调，但不促进纤维化形成或胶原基质的稳定。TG2缺失不会促进肝纤维化的消退。TG2非依赖性胶原交联是进展性肝纤维化的显著特征，是肝纤维化的重要治疗靶点。

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数字

图1
图1。在进行性CCL4诱导的肝纤维化中，转谷氨酰胺酶的表达和活性升高，并与纤维化活动相关
A） 通过肝脏羟脯氨酸进行生化测定，在CCL4治疗后1、3、6和12周，C57Bl/6小鼠的肝脏总胶原蛋白含量逐渐增加。B） CCL4治疗后1周、3周、6周和12周肝脏典型切片结缔组织染色（天狼星红）的低倍图像（原始放大倍率，x50）。C） TG2mRNA表达的时间过程，其中D）与COL1A1（1型前胶原）mRNA强烈相关（Pearson检验）。通过定量RT-PCR测定肝脏转录水平，并在归一化为β2MG mRNA后以任意单位表示（与对照组相比增加了倍）。（E）肝匀浆中的总谷氨酰胺转胺酶活性。所有数据均为平均值±SEM（n=6-8每巴）*，与经溶媒处理的对照组（Ctrl）（ANOVA）相比p<0.05。
图2
图2。胶原溶解度分析表明肝纤维化进展过程中纤维化ECM的交联增加
A） 通过用中性盐、乙酸和胃蛋白酶连续隔夜提取，从1g肝组织中溶解肝胶原蛋白，并通过羟脯氨酸测定对每个组分中的胶原蛋白含量进行生化定量，如M&M中详细描述的那样（0=健康肝脏；1,3,6,12=分别在CCL4治疗后1、3、6、12周出现纤维化肝脏）。数据表示每棒3个样本的平均值±SEM（每个样本来自2-3个肝脏，用于提取和分析）。***，与健康对照组相比，使用ANOVA和Dunnet后验分析p值>0.0001。
图3
图3。CCL4或TAA诱导的晚期肝纤维化野生型和TG2−/−小鼠短期恢复后缺乏自发纤维化回归
在CCL4（A）或TAA（D）诱导6周纤维化高峰时，以及TG2−/-（开放栏）小鼠及其野生型同窝鼠（封闭栏）恢复4周后，通过肝羟脯氨酸进行生化测定的肝胶原蛋白总含量。B） CCL4（B）或TAA（E）治疗6周后以及自然恢复4周后的肝脏代表性切片结缔组织染色（天狼星红）的低倍图像（原始放大倍数×50）。C） 恢复4周后，促纤维蛋白原基因表达正常化。通过定量RT-PCR测定1型前胶原（COL1A1）、转化生长因子β1和TIMP-1的肝转录水平，并在β2MG mRNA标准化后以任意单位表达（与对照组相比增加了倍）。所有数据均为平均值±扫描电镜（n=6-8，每bar）*，与相应基因型的载体对照组（Ctrl）相比p<0.05。#，与纤维化对照组相比，p<0.05（ANOVA）。
图4
图4。患有CCL4诱导的晚期肝纤维化的野生型和TG2−/−小鼠在长达36周的长期恢复后缺乏显著的胶原蛋白去除
野生型（封闭栏）和TG2−/−（开放栏）C57Bl/6小鼠在CCL4诱导6周纤维化高峰以及恢复8、12、24和36周后的相对（A）和总（B）肝胶原含量，通过肝羟脯氨酸进行生化测定。C） 恢复期肝脏体积的代偿性增加与牺牲时肝脏重量测量的肝胶原蛋白相对含量而非总含量的减少相一致。所有数据均为平均值±SEM（每根钢筋的n=6-10）。D） CCL4治疗6周和自然恢复36周后肝脏代表性切片的胶原蛋白（天狼星红）高倍图像（原始放大倍数×200）。E） 肝细胞侵入纤维化间隔是长期恢复期间观察到的一个特征性特征（显示恢复8周后的WT小鼠，原始放大倍数如图所示）。F） 恢复期瘢痕组织重塑的形态计量学分析表明，间隔变宽，浓缩的胶原束分裂为较薄的纤维。使用目镜测微计在×200放大倍数下进行测量。在纤维化高峰和4周后恢复正常时，从左右肝叶和4只小鼠/组的标本中随机选取至少10只完整纤维化间隔，在其中三分之一的外边界处评估间隔厚度和纤维数量，与相应基因型的载体对照组（Ctrl）相比，p<0.05。#，与纤维化对照组相比，p<0.05（ANOVA）。
图5
图5。tTG基因缺失不会影响无纤维化小鼠、晚期纤维化小鼠或长期恢复后胶原的溶解度
如M&M中所述，通过连续提取肝组织和定量提取每个部分中的胶原蛋白，在TG2−/−小鼠（开放栏）和野生型对照组（封闭栏）中测定了纤维化ECM溶解度。仅显示了定量相关的胃蛋白酶可溶性和不溶性部分。Ctrl，车辆创建的非纤维化控件。“纤维化”，纤维化小鼠处于纤维化高峰（CCL4治疗6周）。“恢复”，CCL4治疗被停止，纤维化小鼠被允许再恢复36周。在盐溶性和酸溶性组分中未发现基因型或处理之间的差异，这些组分占总胶原蛋白的5%以下（未显示）。数据表示每棒3个样本的平均值±SEM（每个样本均来自2-3个肝脏，用于提取和分析）。
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