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.2011年2月；138(4):609-17.
doi:10.1242/dev.059097。 Epub 2011年1月5日。

斑马鱼幼体的遗传诱导命运定位揭示了成年胰岛素分泌β细胞的起源

王一云 1, 梅里特谢尔·罗维拉, 沙米拉·优素福, 迈克尔·帕森斯
附属机构

斑马鱼幼体的遗传诱导命运定位揭示了成年胰岛素分泌β细胞的起源

王依云（Yiyun Wang）等人。 开发. 2011年2月.

摘要

众所周知，Notch-signaling通路是控制胰腺分化的基本途径。我们现在报道了使用基于Cre的命运图在幼虫期永久标记胰腺Notch-responsive细胞（PNC），并跟踪其在成年胰腺中的命运。我们发现PNC代表了一个可以分化为多个谱系的祖细胞群体，包括成人导管细胞、中心体细胞（CAC）和内分泌细胞。这些内分泌细胞包括分泌胰岛素的β细胞。CACs是外分泌胰腺的功能成分；然而，我们的命运绘图结果表明，CACs与内分泌细胞的血统关系更密切，因为它们共享一个共同的祖细胞。外分泌胰腺大部分由分泌腺泡细胞组成；然而，我们只检测到PNC对腺泡细胞的作用非常有限。为了解释这一观察结果，我们重新检查了胰腺形成的早期事件。产生外分泌胰腺的胰腺原基位于腹肠内胚层（称为腹芽）。Ptf1a是胰腺外分泌发育所需的基因，最初以腹芽形式表达。我们使用转基因标记系观察表达ptf1a的细胞域和对Notch信号的细胞反应。我们没有发现任何表达重叠，并证明腹芽由两个细胞群组成：一个ptf1表达域和一个Notch-responsive祖细胞核心。随着胰腺器官发生的继续，腹芽衍生的PNC沿着导管排列，保持多能性，随后在发育过程中分化为次级胰岛、导管和CAC。

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数字

图1。
图1。
β-次级胰岛的细胞并非来源于主胰岛β细胞。(A类)实验时间表示意图。β-细胞中的绿色荧光kaede蛋白输入：kaede在72 hpf的紫外线照射下，鱼被光转化为红色荧光蛋白。(B-G公司)显微解剖胰腺的渲染共焦图像输入：kaede在120 hpf下捕鱼。72-120 hpf的（B，F）DAPT治疗诱导次级胰岛（白色箭头），包括以kaede蛋白标记的分化β细胞。（E，G）72 hpf下的光转换用红色荧光标记了该时间点出现的所有β细胞。到120 hpf时，主要胰岛细胞（白色箭头）中仍可见光转换kaede，但在DAPT诱导的次级胰岛（G）中未检测到。比例尺：100μm。
图2。
图2。
胰腺中Cre重组酶活性的调节。(A类)Notch应答型Cre-driver转基因示意图Tp1：创建T2段和(B类)Cre-responder转基因β肌动蛋白：loxP-stop-loxP-hmgb1-mCherry（A）Tol2臂（开放三角形）侧翼12个RBP-Jκ结合位点（灰色圆圈）、β-珠蛋白最小启动子（箭头）和编码4OHT-调节的Cre重组酶（CreER）的基因T2段). （B） β-肌动蛋白增强子/启动子位于loxP-侧翼（黑三角形）翻译停止的上游。(C类)在Cre-dependent重组后，停止盒被移除，允许转录编码核Hmgb1-mCherry（nuc-mCherri）的基因。(D-G公司)GIFM鱼的成年胰腺切片（55 dpf）。（D） 在没有4OHT的情况下，明显存在有限的Cre-activity。（E） 在56 hpf条件下使用4OHT治疗会导致成人（55 dpf）胰腺组织广泛标记。（F，G）β-细胞在GIFM中标记为绿色/英寸：hmgb1-eGFP鱼。（F） 在幼虫未接触4OHT的情况下，β-细胞不会被标记为红色荧光Hmgb1-mCherry。（G） 用幼虫4OHT处理（56 hpf），标记成体β细胞。(小时,我)来自5 dpf GIFM的微量胰腺/Tp1：eGFP幼虫。PNC用GFP荧光标记。（一） 56-80 hpf的4OHT孵育导致75%PNC的Cre依赖性标记为5 dpf。DAPI用于反染细胞核（D-I）。(J型)方框图量化D-I中显示的结果。比例尺：E、G、I中为100μm。
图3。
图3。
早期Notch反应祖细胞对主要胰岛β细胞和外分泌细胞有贡献。(A-P公司)GIFM幼虫在5 dpf下显微解剖胰腺的共焦图像（单光学切片）。鱼类也被转基因用于（A-H）英寸：hmgb1-eGFP（用核GFP标记β细胞）或（I-P）ptf1a:eGFP（用GFP标记腺泡细胞）。如图所示，幼虫被4OHT（4OHT处理）或单独用载体作为阴性对照（–ve对照；D，H，L，P）。在两个不同的发育阶段添加4OHT或载体：12-36hpf，这是一个涵盖胰腺外观的发育阶段（早期）；或56-80 hpf，胰腺成熟期（晚期）。（A，E，I，M）GFP中的组织特异性标记和DAPI中的细胞核（蓝色）。（B，F，J，N）带有红色标记细胞核的线性追踪细胞。（C，G，K，O）红色和绿色图像与亮场融合。组织特异性转基因和谱系标记均呈阳性的细胞呈黄色；示例用黑色箭头表示。在12 hpf（C，K）下添加4OHT后，主要胰岛的β细胞和外分泌胰腺的细胞被标记，但在56 hpf（G，O）下添加时很少被标记。比例尺：D、H、L、P中的20μm。
图4。
图4。
腹芽形成于Notch反应祖细胞和Ptf1a表达细胞的不同群体。 ptf1a:eGFP；Tp1:hmgb1-m樱桃色胚胎在33 hpf（A，B）和37 hpf（C）的共焦显微镜下成像。胚胎的位置为45°（左侧侧视图和背面视图之间的中间位置），以便更好地观察胰腺。(A类)鱼的亮场图像显示方向；a、 前部；p、 后部；d、 背侧；v、 腹侧。左上方是后脑，右下方是卵黄，显示了脊索（n）、背主动脉（da）和肠（i）的位置。(B类,C类)在33（B）和37（C）hpf时合并荧光和亮场图像（单个光学部分）。由于有转基因标记，对Notch信号反应的细胞是红色的（Notch报告），细胞表达ptf1a型为绿色（Ptf1a）。肠管内腔用折线表示，胰腺Ptf1a表达用绿色荧光检测(*). 腹芽的PNC为红色（箭头）。(B′，C'）胰腺发育的渲染视图。GFP的光学切片已被数字切割，以显示C′腹芽的PNC核。比例尺：100μm。
图5。
图5。
胰腺Notch反应祖细胞形成早熟次级胰岛。GIFM显微胰腺切片的（A-C，E）共焦图像；英寸：hmgb1-eGFP幼虫在5 dpf。PNC通过添加56至72 hpf的4OHT进行标记。所有幼虫在DAPT中从72到120 hpf孵化，诱导早熟次级胰岛。(A类)核GFP表达显示β细胞的位置。(B类)Nuclear mCherry对PNC进行了标记，并绘制了其随后的发展命运。所有细胞核均用DAPI（蓝色）复染。(C类)在与亮场图像合并的红/绿图像中，共标记细胞显示为黄色。（A-C）标记次级胰岛的位置(*)并在插入面板中放大，其中谱系追踪β细胞的示例用白色箭头标记。(D类)继发性胰岛诱导GIFM鱼4OHT依赖性命运图和阴性对照（无4OHT）示意图。(E类)未经4OHT治疗，未观察到任何命运图。比例尺：100μm
图6。
图6。
成人胰腺内分泌、导管和中心腺泡细胞来源于幼体Notch反应祖细胞。GIFM幼虫（56 hpf）用4OHT（4OHT处理）或单独载体（–ve对照）处理24小时，并在胰脏切除和冷冻切片前饲养至幼年期（55 dpf）。（A-X）胰腺切片的共焦图像（单个光学切片）。（A、E、I、M、Q）组织特异性转基因或（U）免疫荧光标记的绿色胰腺细胞类型（组织特异性）。用于标记特定成人组织的转基因系：(A-D公司)gcga：绿色荧光蛋白标记α-细胞（α）(E-H公司)英寸：hmgb1-eGFP标记β细胞（β）(I-L公司)SST2：电子GFP标记δ-细胞（δ）(M-P公司)ptf1a:eGFP标记腺泡组织（腺泡）和(Q-T（质量-温度）)Tp1：eGFP标记着丝粒细胞（CAC）（注意GFP信号Tp1：eGFP切片用免疫荧光检测）。(U-X型)免疫荧光染色检测导管标志物细胞角蛋白18（导管）。在“组织特异性”标记细胞和“追踪细胞”的图像中，细胞核用DAPI染色为蓝色。合并的图像包括明亮的视野，以帮助识别细胞形态。（B，F，J，N，R，V）命运映射PNC的后代标记为红色（追踪细胞）。（C，G，K，O，S）通过组织特异性转基因或（W）免疫荧光标记胰腺细胞的PNC子代的命运定位导致双标记细胞在合并图像中显示为黄色（合并图像）。每个面板的宽度代表50μm。
图7。
图7。
腹芽形成模型和对幼虫胰腺的贡献。胰腺由两个独立的腺体形成：一个早期形成的所谓背芽（约20 hpf）；和后期形成的腹芽。显示了胰腺形成的六个阶段，即腹芽衍生组织的出现和贡献。该示意图显示了发育中胰腺的背面视图。肠道上皮的位置用黄色表示。30 hpf时，首先观察到一簇PNC（蓝色圆圈），位于主胰岛前部和腹面（红色圆圈）。在发育稍晚的时候，Ptf1a在靠近PNC、主胰岛前部和腹部的细胞（绿色圆圈）中表达。Ptf1a细胞积极迁移，吞噬PNC（见补充材料中的电影1），并沿肠道内胚层腹表面移动，穿过中线。作为一个单一的实体，Ptf1a/PNCs的腹芽向背侧移动，接触并吞噬主胰岛，形成胰头（头）。Ptf1a细胞增殖并分化为腺泡细胞（较大的绿色圆圈），胰腺伸长形成胰尾（尾部）。PNC围绕着主胰岛并排列在胰腺中央管腔。PNC分化后，在位于尾部的主胰岛和次级胰岛上增加新的内分泌细胞（洋红色圆圈）。
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