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.2011年3月15日；434(3):513-21.
doi:10.1042/BJ20101678。

TRPM7调节极化细胞运动

李廷素 1, 刘伟, 陈香钦, 奥马伊拉·冈萨雷斯-帕甘, 雷蒙德·哈巴斯, Loren W跑步鞋
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TRPM7调节极化细胞运动

李廷素等。 生物化学杂志. .

摘要

TRPM7（瞬时受体电位美拉司他丁7）是一种钙和镁离子通道，具有自己的激酶结构域。作为一种激酶，该蛋白与肌动球蛋白收缩性的控制有关，而该通道被发现可调节细胞粘附以及细胞Mg²+同质化。在本研究中，我们表明，成纤维细胞中RNA干扰导致TRPM7的缺失会改变细胞形态、细胞骨架和细胞形成跛足和执行极化细胞运动的能力。一项下拉纯化分析显示，TRPM7的敲除可以阻止细胞在受到刺激迁移到细胞伤口时激活Rac和Cdc42（细胞分裂周期42）。TRPM7的再表达逆转了这些表型变化，出乎意料的是，TRPM7激酶激活突变体的表达也逆转了这些改变。令人惊讶的是，Mg²+转运体SLC41A2（溶质载体家族41成员2）的表达在恢复细胞形态变化、细胞骨架破坏和通道激酶耗竭引起的定向细胞运动方面也有效。本研究结果揭示了Mg²+在TRPM7对细胞骨架的控制中的重要作用及其调节极化细胞运动的能力。

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数字

图1
图1。TRPM7的耗竭破坏细胞形态
(A类)与野生型（WT）细胞或表达非沉默shRNA（shRNA-C）的成纤维细胞相比，通过RNA干扰在瑞士3T3成纤维细胞（M7shRNA2和M7shRNA 6）中稳定地敲除TRPM7，所产生的细胞具有收缩的形态和长的膜延伸（见箭头）。腺病毒介导的SR-TRPM7和激酶激活的SR-TRP M7-G1618D在TRPM7敲低的M7shRNA6细胞中的重新表达恢复了细胞形态。Mg的表达2+M7shRNA6细胞中的转运体SLC41A2也可以挽救TRPM7耗竭引起的细胞形状变化，而补充含有过量Mg的生长介质2+（10 mM）和钙2+（5 mM）无效。棒材，100μm。(B类)通过测量细胞表面积来量化细胞形态的变化。Box-and-Whisker图描述了细胞表面积的分布。显示的是平均值（平方），25第个百分位数（底线），中位数（中线），75第个百分位数（顶行），75第个百分位+1.5四分位范围（上部晶须）、最小测量值（下部晶须）和最大测量值（×）。星号表示细胞表面积与WT相比存在显著差异，使用Studentt吨试验（P<0.05）。对于每种情况，至少检查三个实验中的150个细胞。
图2
图2。SLC41A2的表达增强了镁对细胞形态的影响2+
(A类)Mg对M7shRNA6细胞的转导2+转运体SLC41A2将M7shRNA6细胞的形态恢复到与表达非沉默shRNA（shRNA-C）的成纤维细胞相似的形状，而使用低5倍的多重感染（MOI）进行转导的效果明显较差（低MOI）。增加镁的浓度2+在10 mM的培养基中，低MOI条件下SLC41A2的转导能力增加，以挽救细胞形态，表明Mg的表达2+补充镁需要瑞士3T3成纤维细胞中的转运体2+以逆转由TRPM7的耗尽引起的细胞形态的变化。棒材，100μm。NT（未经处理），细胞生长在正常镁浓度的培养基中2+（0.95 mM）和钙2+（2.14毫米）。(B类)通过测量细胞表面积来量化细胞形态的变化。Box-and-Whisker图描述了细胞表面积的分布。所示为平均值（平方），25第个百分位数（底线），中位数（中线），75第个百分位数（顶行），75第个百分位+1.5四分位范围（上部晶须）、最小测量值（下部晶须）和最大测量值（×）。星号表示细胞表面积与WT相比存在显著差异，使用Studentt吨试验（P<0.05）。对于每种条件，检查来自三个实验的至少150个细胞。
图3
图3。TRPM7是细胞骨架和局部粘附形成所必需的
(A类)正常镁浓度培养基中培养的WT、shRNA-C和M7shRNA细胞肌动蛋白染色的典型共焦图像2+图中还显示了在10 mM Mg中培养的M7shRNA6细胞2+以及用表达LacZ、SR-TRPM7、激酶活性SR-TRPM 7-G1618D和Mg的重组腺病毒转导的M7shRNA6细胞2+运输车SLC41A2。从两个实验中检查了每种情况下至少80个细胞。(B类)肌球蛋白IIA染色的代表性共焦图像。(C类)vinculin染色的典型共焦图像。棒材，100μm。有关结果的量化，请参见补充图S4A和S4B。
图4
图4。跛足型编队需要TRPM7
(A类)Western blot分析0分钟和10分钟细胞损伤试验期间激活的Rho和Rac水平，以及细胞裂解物中每种蛋白质的总量。TRPM7的敲除降低了Rho和Rac的激活。(B类)GTP-结合蛋白的定量标准化为每个蛋白的总量。结果显示为细胞损伤试验中0分钟时与shRNA-C细胞相比的倍数变化。数值表示为至少三个实验的平均值±标准偏差。星号表示与shRNA-C细胞相比，M7shRNA6细胞的Rho活性（P=0.0235）和Rac活性（P=0.0073）在0到10分钟内的变化，使用Studentt吨经检验（P<0.05），差异显著。(C类)创伤后4小时伤口边缘处的膜突起的代表性图像。箭头表示宽脚足，而箭头表示假脚足。棒材，100μm。(天)在细胞伤口愈合分析中，使用跛足足迁移的细胞与使用假足足迁移细胞的百分比的量化。对每种情况下的大约150个细胞进行了检查。数值表示为三个实验的平均值±标准偏差。星号表示与M7shRNA6细胞相比，使用Studentt吨经检验（P<0.05），差异显著。
图5
图5。细胞极化和定向细胞迁移需要TRPM7
(A类)在0分钟和10分钟细胞损伤试验期间，对GTP-Cdc42水平和Cdc42总量进行Western blot分析。TRPM7的敲除改变了激活的Cdc42的水平，与对照细胞相比，敲除细胞中激活的Cdc42在0分钟时异常高。尽管对照细胞中Cdc42的活性在伤口形成后0至10分钟增加，但在相同条件下，TRPM7敲低细胞中活化的Cdc42的水平没有增加。(B类)GTP-Cdc42的定量标准化为Cdc42蛋白的总量。结果显示为0分钟时与shRNA-C细胞相比的倍数变化。数值表示为四个实验的平均值±标准偏差。与shRNA-C细胞相比，M7shRNA6细胞中Cdc42活性在0到10分钟内的变化（P=0.0267），使用Studentt吨经检验（P<0.05），差异显著。(C类)细胞损伤分析中单个细胞迁移路径的典型示例。单个细胞在6小时内从伤口边缘的迁移路径显示为黑色路径，0分钟成像开始时的图像重叠。(天)量化向中线方向移动到伤口区域的细胞与向中线方向非方向移动到创伤区域的细胞的百分比。“非定向”移动的细胞被定义为朝中线方向旋转或反转的细胞。对每种情况下大约150个细胞进行了检查。数值表示为三个实验的平均值±标准偏差。星号表示与M7shRNA6细胞相比，使用Studentt吨经检验（P<0.05），差异显著。(E类)高尔基重新定向。细胞固定并用β-COP抗体染色，以显示创伤后6小时高尔基体的分布。箭头指示伤口的方向。棒材，100μm。(F类)测量了前向120度扇区具有高尔基体的细胞百分比。数值表示为至少三个实验的平均值±标准偏差。每种情况下至少检查150个细胞。星号表示极化高尔基体与WT细胞的百分比存在显著差异，使用Studentt吨试验（P<0.01）。棒材，100μm。
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