Flotillins play an essential role in Niemann-Pick C1-like 1-mediated cholesterol uptake

doi:10.1073/pnas.1014434108

.2011年1月11日；108(2):551-6.

doi:10.1073/pnas.1014434108。 Epub 2010年12月27日。

Flotillins在Niemann-Pick C1-like 1-介导的胆固醇摄取中发挥重要作用

梁戈¹, 魏琦, 王丽娟, 苗宏华, 玉秀区, 李伯良, 宝亮颂

附属公司

PMID： 21187433
预防性维修识别码：项目经理3021008
内政部： 10.1073/pnas.1014434108

Flotillins在Niemann-Pick C1-like 1-介导的胆固醇摄取中发挥重要作用

梁戈等。美国国家科学院程序. 2011.

.2011年1月11日；108(2):551-6.

doi:10.1073/pnas.1014434108。 Epub 2010年12月27日。

作者

梁戈¹, 魏琦, 王丽娟, 红花苗, 玉秀区, 李伯良, 宝亮颂

附属

¹中国科学院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室，上海市岳阳路320号，邮编200031。

PMID： 21187433
预防性维修识别码：项目经理3021008
内政部： 10.1073/pnas.1014434108

摘要

饮食吸收是哺乳动物获取胆固醇的主要途径，胆固醇由Niemann-Pick C1-like 1（NPC1L1）通过囊泡内吞作用介导。这个过程中的一个基本问题是如何通过NPC1L1的内化有效地吸收游离胆固醇。利用外源性表达的NPC1L1-EGFP，我们表明脂筏蛋白浮子与NPC1L1相关，它们的定位在细胞内运输过程中受NPC1L1.调节。此外，flotillins对NPC1L1介导的小鼠细胞胆固醇摄取、胆汁胆固醇重吸收和调节脂质水平至关重要。它们与NPC1L1一起形成富含胆固醇的膜微域，作为大部分胆固醇的载体。低胆固醇药物ezetimibe破坏了NPC1L1和flotillins之间的联系，从而阻止了富含胆固醇的微结构域的形成。我们的研究结果揭示了flotillins在NPC1L1介导的胆固醇摄取中的功能性作用，并阐明了NPC1L1-氟西林阳性胆固醇富集膜微结构域的形成是有效胆固醇吸收的机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
小队与NPC1L1相关。(A类)NPC1L1–flotillins复合物在胆固醇摄取过程中组成。CRL1601–NPC1L1-EGFP细胞在胆固醇消耗培养基中培养60分钟，以去除胆固醇，然后在含有15μg/mL胆固醇的胆固醇补充培养基中孵育指定时间，以补充胆固醇。用抗EGFP偶联琼脂糖进行IP，并用免疫印迹（IB）检测指示蛋白。Ctr，对照；μ2，AP2复合亚基μ2；船队，船队；Tnr，转铁蛋白受体。(B类–E类)flotillin-1的胆固醇调节再循环依赖于NPC1L1。(B类和C类)Flotillin-1-RFP与NPC1L1-EGFP共表达(B类)或EGFP(C类)在CRL1601单元中。48小时后，如图1所示，将细胞中的胆固醇耗尽60分钟，然后补充胆固醇60分钟A类在不同的时间点，即稳态（SS）、胆固醇消耗（CD）和胆固醇补充（CR），固定细胞并用共焦显微镜检查。（比例尺：10μm或1μm，放大图像。）(天和E类)PM-localized flotillin-1号(天)或重叠系数(E类)NPC1L1-EGFP和船队-1-RFP之间，如B类和C类被量化。误差线代表标准偏差(n个≥50). (如果和*G公司*)FRAP分析。用所示质粒转染CRL1601细胞。48小时后，细胞在胆固醇消耗培养基中培养60分钟，以去除胆固醇。然后将细胞保存在不含环糊精的胆固醇消耗介质中，并进行FRAP实验。每个样品中的NPC1L1-EGFP在PM上的指定区域进行漂白，并监测NPC1L1/EGFP的荧光恢复(*G公司*)并量化(如果). 误差条表示标准偏差(n个≥20).

**图2。**
击倒鱼群蛋白会损害NPC1L1介导的胆固醇摄取。(A类和B类)用Q-PCR和免疫印迹（IB）测定船队的击倒效率。分别用指示的siRNA转染CRL1601–NPC1L1-EGFP细胞。96 h后，进行Q-PCR检测flotillin-1和flotillin-2的表达水平(A类)或收获细胞进行IB(B类). 误差线代表三个实验的标准偏差。Ctr，对照；船队，船队；Tnr，转铁蛋白受体。(C类–如果)磷脂是NPC1L1-EGFP和胆固醇内化所必需的。如图1所示，CRL1601–转染有所示siRNAs的NPC1L1-EGFP细胞在胆固醇耗尽后补充胆固醇60分钟A类固定细胞，用filipin染色，并用双光子共聚焦显微镜检查。（比例尺：10μm）(天)细胞内定位NPC1L1和胆固醇的定量C类误差条代表标准偏差(n个≥100). (E类)CRL1601–NPC1L1-EGFP细胞转染了指示的siRNAs并去除了胆固醇，如C类然后在指定的时间段内用胆固醇补充细胞，并进行表面生物素化实验以分析NPC1L1的内吞作用。代表，胆固醇补充。(如果)如图1所示，CRL1601–转染有所示siRNAs的NPC1L1-EGFP细胞在60分钟（时间点0）内去除胆固醇，然后在60分钟内补充胆固醇A类测量时间点0（Chol#1）和60（Chol#2）的胆固醇水平。净胆固醇摄取量是通过从胆固醇#2中减去胆固醇#1来计算的。误差线代表三个实验的标准偏差。

**图3。**
腺病毒介导的小鼠肝脏中flotillins的敲除影响NPC1L1介导的胆汁胆固醇重吸收和血脂水平。用表达NPC1L1-EGFP的腺病毒（Ad）感染8周龄雄性（每组5只）小鼠(A类)或腺病毒的指示组合(B类–*L（左）*). 四天后，不同的组织(A类)或肝脏(B类)收集并进行免疫印迹（IB）分析。船队，船队。用兔多克隆抗Mrp2抗体对肝脏冰冻切片进行染色，并用共焦显微镜进行检查(C类). （比例尺：10μm）胆汁胆固醇（胆固醇）(天)，磷脂（PL）(E类)，和胆汁酸（BA）(如果)进行了测量。肝胆固醇(*G公司*)和PL(*H（H）*)进行了分析。血浆总胆固醇(我)、甘油三酯（TG）(J)，低密度脂蛋白胆固醇(K)、和HDL-c(*L（左）*)已确定。使用双向方差分析[Tukey的HSD（诚实显著差异）后验]进行统计分析***第页 < 0.0001, **第页 < 0.01, *第页 < 0.05. 误差线代表标准偏差(n个 = 5).

**图4。**
在蔗糖梯度超速离心试验中，NPC1L1增加了低密度脂蛋白（LDF）中flotillins和胆固醇的分布。(A类)NPCL1-EGFP、Flotillin-1-RFP和胆固醇的凝胶化。在CRL1601细胞中共转染Flotillin-1-RFP和NPC1L1-EGFP质粒。48小时后，细胞内胆固醇耗尽，随后补充胆固醇，如图1所示A类然后固定细胞，用filipin染色，并用双光子共聚焦显微镜检查。（比例尺：10μm）(B类–*G公司*)蔗糖梯度超速离心分析。(B类)CRL1601（对照）和CRL1601-NPC1L1-EGFP细胞在胆固醇耗尽后补充胆固醇，如图1所示A类纯化血浆内吞膜并进行免疫印迹（IB）检测。T、总细胞裂解物；M、膜分数。T、总量；M、膜组分；浮标-1，浮标-1；CREB、c-AMP反应元件结合；转铁蛋白受体；内质网。(C类)纯化的P/E膜进行蔗糖梯度超速离心。用IB分析每个组分中的指示蛋白，用斑点杂交检测GM1。(天)LDF中的蛋白质和GM1被量化为相对于总量。误差线代表三个实验的标准偏差。(E类–*G公司*)胆固醇(E类)，个(如果)和SM(*G公司*)测定了每个组分的含量。(*H（H）*)LDF中胆固醇、PC、SM和GM1的增加倍。使用公式（脂质）计算增加倍数_{CRL1601–NPC1L1-EGFP}-脂质_邮编1601)/脂质_CRL1601型误差条表示三个实验的标准偏差。控制中心。

**图5。**
依泽替米贝通过分离NPC1L1和浮子蛋白之间的结合来抑制富含胆固醇的膜微结构域的形成。(A类)Ezetimibe分离培养细胞中NPC1L1和flotillins之间的联系。将胆固醇耗尽的CRL1601–NPC1L1-EGFP细胞在不使用或使用依泽替米贝的情况下培养，并补充胆固醇30分钟。IP采用抗EGFP偶联琼脂糖进行。用所示抗体进行免疫印迹（IB）。Ctr，对照；μ2，AP2复合亚基μ2；船队，船队；转铁蛋白受体；代表，补充。(B类)依泽替米贝分解小鼠肠道中的NPC1L1–flotillins复合物。每天用悬浮在0.5%甲基纤维素或甲基纤维素（对照）中的10 mg/kg依泽替米贝灌胃8周龄C57/B6雄性小鼠3天。在第四天，即用依泽替米贝灌胃2小时后，处死小鼠并收集小肠粘膜。纯化膜组分并在含有2%洋地黄素的IP缓冲液中溶解，然后高速离心丢弃碎片。上清液与5μg免疫纯化抗NPC1L1抗体孵育1h。然后添加蛋白A琼脂糖，并在4 摄氏度。用含有0.5%洋地黄素的IP缓冲液洗涤琼脂糖五次，然后进行IB。(C类和天)FRAP分析。用所示质粒转染CRL1601细胞。转染后（48小时），在不使用或使用依泽替米贝的情况下处理细胞，并去除胆固醇60分钟。然后在PM上的指定区域对每个样品的NPC1L1-EGFP进行漂白，并监测NPC1L1/EGFP的荧光恢复(天)并量化(C类). 误差线代表标准偏差(n个≥20). (E类–*G公司*)依泽替米贝可抑制富含胆固醇的膜微结构域的形成。不使用或使用依折麦布处理胆固醇耗尽的CRL1601–NPC1L1-EGFP细胞，并补充胆固醇。进行蔗糖梯度超速离心。收集部分并进行IB–斑点杂交(E类)和胆固醇测定(如果). 定量LDF中蛋白质和GM1的相对数量(*G公司*). 误差线代表三个实验的标准偏差。

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