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.2010年12月15日；9(24):4931-40.
doi:10.4161/cc.9.24.14229。 Epub 2010年12月15日。

一氧化氮介导的肿瘤EMT抑制机制：抑制转移诱导因子蜗牛和诱导转移抑制因子RKIP

斯塔夫罗拉·巴里塔基 1, 萨拉·韦尔塔-耶佩兹, 安娜·萨哈基恩, Iordanis Karagiannides公司, 基里亚基·巴科尔齐, 阿里·贾齐雷希, 本杰明·博纳维达
附属公司

一氧化氮介导的肿瘤EMT抑制机制：抑制转移诱导因子蜗牛和诱导转移抑制因子RKIP

斯塔夫罗拉·巴里塔基等。 细胞周期. .

摘要

一氧化氮（NO）在癌症中的作用一直存在争议，这是基于NO水平和肿瘤类型的反应性。目前尚不清楚NO是否能抑制癌细胞的上皮-间充质转化（EMT）。EMT诱导在一定程度上是由转移诱导因子的组成性激活介导的，蜗牛和EMT可以被转移抑制剂Raf-1激酶抑制剂蛋白（RKIP）和E-cadherin抑制。蜗牛受NF-κB转录调节，反过来，蜗牛抑制RKIP转录。因此，我们假设高水平的NO抑制NF-κB活性，也可能抑制Snail并诱导RKIP，从而抑制EMT。我们发现，用NO供体DETANONOate治疗人类前列腺转移细胞系可以抑制EMT，并逆转间充质表型和细胞侵袭性。此外，DETANONOate治疗抑制蜗牛表达和DNA结合活性，同时上调RKIP和E-cadherin蛋白水平。通过siRNA沉默蜗牛和异位表达RKIP证实了蜗牛抑制和RKIP诱导在DETANONOate介导的EMT抑制中的关键作用。体外研究结果在携带PC-3异种移植物并用DETANONOate治疗的小鼠体内得到验证。本研究结果首次表明，高亚毒性浓度NO在抑制EMT中的新作用。因此，NO供体可能在逆转EMT和转移中发挥治疗作用。

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图1
图1
DETANONOate抑制NFκB并逆转间充质细胞和侵袭性细胞表型。（A） DETANONOate逆转间充质细胞表型。在用1000µM DETANONOate处理4和12 h前后，对来自DU-145和PC-3细胞的蛋白裂解物进行western blot分析，以测定E-cadherin、vimentin和fibronectin的表达。肌动蛋白被用作加载的内部控制。（B） DETANNOATE抑制DU145细胞的侵袭特性。2.5 × 104将DU-145细胞接种在方法所述的体外侵袭检测系统的上腔中，同时在下腔中添加含有10%FBS的RPMI 1640。用200、500或1000µM DETANNOate处理或不处理细胞，并孵育22小时。基质凝胶膜固定并用结晶紫染色后，在显微镜下计数侵入的细胞。数据表示为通过基质凝胶基质和膜的侵入百分比，相对于通过对照插入膜的迁移。p<0.03处理细胞与未处理细胞（Mann-Whitney U检验）。（C） DETANONOate对NFκB DNA结合活性的抑制。用500或1000μM DETANONOate处理DU145细胞4 h，并对衍生的核提取物进行EMSA处理。β-actin水平作为负荷控制。
图2
图2
DETANONOate抑制蜗牛的表达和活动。（A） DETANONOate抑制蜗牛表达。分别通过实时PCR和western blot分析评估1000μM DETANONOate处理细胞后蜗牛转录物（上部）和蛋白质水平（下部）的时间动力学分析。蜗牛转录水平的抑制表现为扩增产物的标准化周期阈值（Ct）随时间的增加。在相同样本中评估的GAPDH的Ct值用作正常化对照。数据表示为三次执行的一次实验的平均标准化Ct值±STDEV*p<0.05：处理细胞与未处理细胞。（B） DETANONOate对蜗牛DNA结合活性的抑制作用。在不含DETANONOate的无血清培养基中培养DU145细胞30分钟或4小时。使用生物素标记的寡核苷酸蜗牛探针，通过EMSA评估蜗牛的DNA结合活性。（C） DETANONOate诱导蜗牛蛋白S-亚硝基化。DETANONOate治疗后S-亚硝基化蜗牛的免疫沉淀（1000μM，4 h）。如材料和方法中所述，在使用蛋白A珠的免疫沉淀测定中使用总细胞裂解物。用抗S-亚硝基半胱氨酸（SNO-Cys）抗体沉淀S-亚硝酸盐化蛋白，用蜗牛多克隆抗体免疫印迹膜。兔IgG作为阴性对照。（D） 蜗牛抑制在eMt抑制中的直接作用。使用蜗牛siRNA抑制蜗牛72小时后，从DU 145细胞中获取总细胞裂解物，并进行western blot分析，以测定所示基因产物的蛋白表达。在转染试验中使用随机核苷酸序列（CNTR siRNA）作为对照。Actin被用作内部控制。
图3
图3
DETANONOate上调RKIP表达。（A） 通过实时PCR评估，DETANONOate上调PC-3细胞中的RKIP转录水平。RKIP转录水平的诱导表现为扩增产物的标准化周期阈值（Ct）随时间的降低。在相同样本中评估的GAPDH的Ct值用作正常化对照。数据表示为一次实验的平均标准化Ct值±STDEV，分三次进行*p<0.05：处理细胞与未处理细胞。（B） DETANONOate诱导RKIP蛋白表达。在用DETANNOATE处理后4和12小时收获来自DU145和PC-3细胞的蛋白质裂解物，并进行蛋白质印迹分析以测定RKIP蛋白质。（C） 蜗牛对RKIp启动子活性的调节。将蜗牛siRNA或相对对照siRNA与pRKIP-Luc野生型（pRKIP-Luc w/t）或突变了5个E-box中3个的pRKIP-Luc突变体（pRKIP-Luc mut）启动子构建物共同转染DU145细胞*p=0.013：转染与转染，并用蜗牛siRNA细胞处理。（D） RKIP在EMT抑制中的直接作用。在使用CMV-HA-RKIP载体过度表达RKIP 48 h后，从DU145细胞中获取总细胞裂解物，并进行western blot分析，以测定所示基因产物的蛋白表达。使用CMV空载体（CMV-HA-EV）作为阴性转染对照。（E） siRNA沉默RKIP可逆转DETANOOATE介导的对DU145细胞EMT表型的抑制。用RKIP siRNA或对照siRNA预处理细胞70 h，然后再暴露于DETANONOate（1000 uM）中12 h。使用随机核苷酸序列（CNTR siRNA）作为阴性沉默对照。western blot分析检测RKIP、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。肌动蛋白被用作所有蛋白质分析的内部对照。
图4
图4
在携带PC-3异种移植物的小鼠中验证NO介导的间充质细胞表型逆转。（A） 500和1000μM DETANONOate治疗后PC-3细胞纤维连接蛋白、波形蛋白和E-cadherin表达的免疫组织化学分析。兔IgG对照用作阴性对照。（B） PC-3肿瘤小鼠活检组织中RKIP、蜗牛、纤维连接蛋白和E-cadherin表达的代表性免疫组织化学染色。如上所述，使用兔IgG对照作为阴性对照。
图5
图5
κB/Snail/RKIP在DETANNOate介导的EMT抑制中的串扰。我们认为，NO-介导的NFκB活性抑制不仅是EMT反应的调节剂，而且还通过调节下游EMT相关靶点（如蜗牛）发挥调节作用。NO介导的对蜗牛表达和活性的抑制反过来导致其转录靶点RKIP和E-cadherin的去表达，以及蜗牛调节的间充质标记物的抑制。除了NO直接介导的抑制外，RKIP诱导通过NFκB抑制直接减弱蜗牛抑制的反馈回路。上述基因产物的表达和活性的所报告的修饰构成了一种可能的机制，通过这种机制，DETANONOate可以在体内外抑制间充质细胞表型以及转移前列腺细胞的迁移和侵袭特性。
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