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.2011年4月；39(8):3026-41.
doi:10.1093/nar/gkq1003。 Epub 2010年12月10日。

CD44 3'-非翻译区的表达调节内源性microRNA在肿瘤发生和血管生成中的功能

吉娜·杰亚帕兰 1, 赵群登, 塔蒂亚娜·沙泽娃, 凌芳, 何成燕, 伯顿·B·杨
附属公司

CD44 3'-非翻译区的表达调节内源性microRNA在肿瘤发生和血管生成中的功能

吉娜·杰亚帕兰等。 核酸研究. 2011年4月.

摘要

非编码3’-非翻译区（UTR）在调节microRNA（miRNA）功能中起着重要作用，因为它可以结合和灭活多个miRNA。在这里，我们发现CD44的3'-UTR能够拮抗细胞质miRNA，并导致CD44和下游靶mRNA CDC42的翻译增加。人类乳腺癌细胞系MT-1的一系列细胞功能检测表明，CD44 3'-UTR抑制增殖、集落形成和肿瘤生长。此外，它调节内皮细胞活性，促进血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，并增加对多西他赛的敏感性。这些结果是由于CD44 3'-UTR与多个miRNAs的相互作用。计算算法预测了三种miRNAs，miR-216a、miR-330和miR-608，可以与CD44和CDC42 3'-UTR结合。通过荧光素酶分析、western blotting和免疫组织化学染色证实了这一点，并与一系列siRNA分析相关联。因此，非编码CD44 3'-UTR作为miRNA结合的竞争对手，随后通过释放靶mRNA而使miRNA功能失活。

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数字

图1。
图1。
CD44 3′-UTR降低细胞增殖和肿瘤形成。(一)将CD44 3′-UTR片段（900 bp）插入CMV启动子、NheI和ApaI位点下游的pcDNA3.1质粒中，生成CD44-UTR构建物。对CD44 3′-UTR和对照细胞的总RNA进行RT-PCR，并用琼脂糖凝胶电泳进行分析。与对照细胞相比，CD44 3′-UTR细胞的CD44 3’-UTR表达增加。实时PCR分析显示，CD44 3′-UTR细胞中的CD44 3’-UTR水平比对照细胞增加了3倍**P（P） < 0.01. (b条)对CD44 3′-UTR、对照细胞和CD44E转染细胞进行培养，并在5天内计算细胞数量。CD44 3′-UTR降低MT-1细胞的增殖。n个============================================================================5, **P（P） < 0.01. (c（c）)与CD44 3′-UTR细胞相比，对照细胞和CD44E细胞在含有2%FBS的低熔点琼脂糖中形成更大的3D菌落，并且每个培养皿中形成的菌落数量更多。n个============================================================================3, *P（P） < 0.05之间。(d日)通过FACs分析确定的细胞周期分布，CD44 3′-UTR细胞在G1期的数量较多，在S期和G2期的细胞数量较少（左）。典型的FAC剖面如图所示（右）。n个============================================================================3, *P（P） < 0.05之间。(e（电子）)将稳定转染CD44 3′-UTR或对照质粒的MT-1细胞皮下注射到裸鼠体内，监测肿瘤生长15天。与载体对照组相比，CD44 3′-UTR的表达降低了肿瘤生长（左）。典型的小鼠和肿瘤大小如图所示（右）。n个============================================================================10, *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图2。
图2。
CD44 3′-UTR促进细胞死亡。(一)CD44 3′-UTR和对照细胞在低血清和无血清条件下保存在组织培养皿中。收集存活细胞并进行计数。CD44 3′-UTR细胞的存活率下降（上部）。细胞存活率也通过光学显微镜和照片进行监测（下图）。n个============================================================================3, **P（P） < 0.01，比例尺=100µm。(b条)CD44 3′-UTR和对照细胞在低血清和无血清条件下培养5天。用Annexin V和PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。在0%和1%血清条件下，与对照细胞相比，3′-UTR细胞的凋亡细胞（Annexin V阳性、PI阳性、AnnexinV和PI阳性）数量更多。(c（c）)对CD44 3′-UTR肿瘤切片和对照组进行联合免疫染色，以检测CD44（红色）和凋亡细胞（绿色）的表达。表达高水平CD44的细胞区域与凋亡细胞相关。
图3。
图3。
CD44 3′-UTR表达促进内皮细胞活性和血管生成。(一)将YPEN-1细胞与CD44 3′-UTR和对照细胞混合，接种在Matrigel™中。用光学显微镜检查试管形成。CD44 3′-UTR与YPEN-1细胞混合后，与对照细胞相比，形成较大的复合物和较长的管。低倍比例尺=400µm，高倍比例杆=100µm。(b条)用抗CD34抗体对CD44 3′-UTR和对照肿瘤切片进行染色。与对照组相比，CD44 3′-UTR肿瘤切片中的血管（箭头）数量增加。比例尺=50µm。(c（c）)肿瘤切片用TUNEL联合免疫染色检测凋亡细胞（绿色）和CD34检测血管（红色）。与对照组相比，CD44 3′-UTR肿瘤切片的凋亡细胞死亡和血管数量增加。
图4。
图4。
通过miR-216a、miR-330和miR-608靶向CDC42。(一)CD44 3′-UTR的计算分析表明，miR-216a、miR-330和miR-608可以与CD44和CDC42 3′-UTRs相互作用。显示了miR-216a、miR-330和miR-608与CD44（上部）的预测结合序列以及这些miRNAs对CDC42 3′-UTR的靶向性（下部）。CDC42种子区的突变序列为红色(b条)我们假设CD44 3′-UTR的过度表达会吸引内源性miR-216a、miR-330和miR-608，从而释放CD44和CDC42 mRNA用于翻译。(c（c）)将CDC42 3′-UTR片段克隆到荧光素酶报告载体pMir-Report中。用不同的miRNAs和荧光素酶报告子构建物共同转染MT-1细胞，在MT-1细胞中携带CDC42 3′-UTR或突变CDC42片段。一个非相关的cDNA片段被用作对照。萤光素酶活性测定表明，当三种miRNA携带相应的CDC42 3′-UTR时，它们都抑制萤光素酶活性，当潜在的miRNA靶位点突变时，这种活性被逆转。n个============================================================================3中*P（P） < 0.05之间。(d日)荧光素酶报告质粒与相应的miRNAs或对照序列以及pcDNA3.1–CD44 3′-UTR或pcDNA3.1-G3R共同转染MT-1细胞。在pcDNA3.1-CD44 3′-UTR存在下，miRNAs的抑制作用可以显著恢复。n个============================================================================3, *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. (e（电子）)携带CD44 3′-UTR（Luc-CD44 3’-UTR）或对照的荧光素酶报告载体在MT-1细胞中以不同浓度转染。荧光素酶活性标准化为100%。Luc-CD44 3′-UTR的萤光素酶活性从未达到对照值。然而，荧光素酶活性随着质粒剂量的增加而增加。CD44 3′-UTR浓度增加导致荧光素酶活性增加。n个============================================================================3. (如果)将Luc-CD44 3′-UTR或对照与不同数量的pcDNA3.1-CD44 3′-UTR构建物在MT-1细胞中共同转染。随着pcDNA3.1-CD44 3′-UTR的增加，更多内源性miRNAs被结合，释放荧光素酶蛋白的翻译，导致荧光素酶活性升高。n个============================================================================三。
图5。
图5。
在表达CD44 3′-UTR的细胞中上调CD44和CDC42的表达。(一)从CD44 3′-UTR和载体转染细胞制备蛋白裂解物，并用抗CD44和-CDC42抗体进行western blot分析。在相同的膜上检测β-肌动蛋白作为负荷控制。在CD44 3′-UTR转染的细胞中检测到CD44和CDC42的表达增加。(b条)从CD44 3′-UTR和CD44E转染细胞制备蛋白裂解物，并用抗CD44和-CDC42抗体进行western blot分析。虽然CD44E转染增加了CD44的表达，但并没有增加CDC42的水平。(c（c）)用抗CD44和-CDC42抗体对肿瘤切片进行免疫组化。与对照组相比，CD44 3′-UTR肿瘤切片中的CD44和CDC42增加。比例尺=100µm。(d日)从CD44 3′-UTR和对照肿瘤制备蛋白裂解物，并用抗CD44和-CDC42抗体进行western blot分析。在相同的膜上检测β-肌动蛋白作为负荷控制。CD44 3′-UTR肿瘤中CD44和CDC42均上调。
图6。
图6。
人类乳腺癌细胞中CD44表达降低。对7例乳腺癌标本进行CD44表达检测。导管细胞（DC）中CD44水平显著降低，显示乳腺癌细胞（BCC）的表型。提供了一张显示乳腺正常导管的照片和一张显示二次抗体染色的照片（下图）。比例尺=50µm。
图7。
图7。
MT-1细胞系中miR-216a、miR-330和miR-608的功能。(一)在转染miR-216a、miR-330和miR-608的CD44 3′-UTR细胞中测量5天的增殖率。miR-330的表达增加了CD44 3′-UTR细胞的增殖。n个============================================================================5, **P（P） < 0.01之间。(b条)通过FACs分析分析miRNA转染CD44 3′-UTR细胞的细胞周期进展。miR-330转染降低了CD44 3′-UTR细胞中G1细胞的数量，但增加了G2和S细胞的数量。n个============================================================================3. (c（c）)检测转染miR-216a、miR-330和miR-608的CD44 3′-UTR MT-1细胞的细胞存活率。miR-216a、miR-330和miR-608的表达增加了细胞活力。n个============================================================================5, **P（P） < 0.01. (d日)分析转染miR-216a、miR-330和miR-608的CD44 3′-UTR细胞中的试管形成。miR-216a和miR-608的表达抑制了CD44 3′-UTR MT-1细胞系中小管结构的形成。比例尺=250μm。(e（电子）)western blot分析转染MT-1细胞的miRNAs的细胞裂解产物。这三种miRNAs的表达抑制了CDC42水平。
图8。
图8。
抗CD44 3′-UTR的siRNA增强增殖，降低CD44和CDC42蛋白水平和凋亡。(一)从转染不同靶向CD44 3′-UTR的siRNA的CD44 3’-UTR细胞中收集总RNA。这些样本用于RT-PCR，以测量CD44 mRNA水平。所有siRNA均降低CD44 mRNA水平(b条)用靶向CD44 3′-UTR的不同siRNA转染CD44 3’-UTR和对照细胞。细胞裂解物进行western blot分析。靶向CD44 3′-UTR的siRNA导致CD44和CDC42水平降低。(c（c）)分析了细胞周期分布。与G1群体增加的对照组相比，siRNA处理的细胞的S期和G2期增加。n个============================================================================3. (d日)使用Annexin V染色分析siRNA处理的细胞凋亡。与对照组相比，使用siRNA-187、siRNA-541和siRNA-650的处理降低了细胞凋亡。n个============================================================================5
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参考文献

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