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.2010年12月8日；30(49):16718-29.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3686-10.2010。

GluA1的活性依赖性泛素化介导独特的AMPA受体内吞和分选途径

林赛·A·施瓦兹 1, 本杰明·J·霍尔, 绅士N Patrick
附属公司

GluA1的活性依赖性泛素化介导独特的AMPA受体内吞和分选途径

林赛·A·施瓦兹等人。 神经科学. .

摘要

AMPA受体（AMPAR）在突触之间的准确运输是大脑学习和记忆的关键组成部分，而AMPAR运输的功能障碍被假设为阿尔茨海默病的潜在机制。先前的工作表明，完整膜蛋白的泛素化是一种常见的翻译后修饰，用于调节真核细胞中表面蛋白的内吞和内吞分选。在这里，我们报告了哺乳动物AMPAR因其激活而变得泛素化。使用一种在C末端赖氨酸处不能泛素化的GluA1突变体，我们证明泛素化是表面AMPAR内化及其向溶酶体转运以响应AMPAR激动剂AMPA而不是AMPAR对NMDA受体激动剂NMDA的内化所必需的。通过过度表达或RNA干扰介导的敲除，我们确定了一种特定的E3连接酶Nedd4-1（神经前体细胞表达的发育下调基因4-1）对这一过程是必要的。最后，我们表明，随着神经元的成熟，Nedd4-1对GluA1的泛素化变得更加普遍。总之，这些数据表明，Nedd4-1对含GluA1的AMPAR的泛素化介导了它们的内吞作用和向溶酶体的转运。此外，这些结果揭示了海马神经元如何以高度特异性调节AMPAR的运输和降解，以响应不同的神经元信号线索，并表明随着神经元的成熟，这一途径可能发生变化。

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数字

图1。
图1。
含GluA1的AMPAR经历活性介导的泛素化。A类用AMPA（100μ米，10分钟）或在用抗GluA1、抗GluA2或抗NR1抗体免疫沉淀产生的裂解物之前未经处理。通过Western blot解析IP，并用抗泛素抗体和针对每个受体亚单位的抗体进行探测，以确认每个IP中的蛋白质水平相等。B类，量化归一化平均泛素强度。C类，量化IP受体强度除以GluA1和GluA2 IP的输入受体强度。n个=每种情况下3-4个IP*第页<0.05，未成对学生t吨测试。误差条表示SEM。
图2。
图2。
含GluA1的AMPAR的泛素化依赖于AMPAR活化和钙。A类用AMPA（100μ米)，CNQX（40μ米)+AMPA，钙2+-自由介质+AMPA，APV（50μ米)+AMPA，NMDA（25μ米)或在IP前用抗GluA1抗体进行治疗。通过Western blot解析IP，并用抗泛素和抗GluA1抗体进行检测。B类，归一化平均泛素的量化。n个=每种情况下4-8个IP*第页<0.05，Tukey's方差分析事后（post-hoc）测试。误差条表示SEM。
图3。
图3。
C-末端的泛素化对于AMPA介导而非NMDA介导的GluA1内吞是必需的。A类，GFP标记的GluA1 C末端示意图强调了赖氨酸残基是泛素化的潜在位点。GFP–GluA1–4KR将所有四个C端赖氨酸突变为精氨酸。B类，感染GluA1-WT或GluA1-4KR病毒的分离海马神经元的代表性图像。表面（红色）和内部（绿色）GFP–GluA1群体用抗GFP抗体离散标记。n个=28个WT电池和n个=4个实验中4KR的30个电池。C类，经AMPA（100μ米)或NMDA（25μ米)持续5-10分钟。D类，量化受感染神经元胞体或树突中内化的GluA1–WT或GluA1-4KR强度。n个=在4个实验中，每次处理30–45个细胞*第页<0.05，方差分析，Fisher最小显著性差异事后（post-hoc）测试。误差条表示SEM。比例尺，10μm。
图4。
图4。
Nedd4-1与GluA1的表面表达相互作用并调节其表达。A类Nedd4-1（N4-1）或GluA1通过IP与成熟海马组织中的Nedd4-1或GluAl抗体分离。通过Western blot解析IP，并用抗GluA1或抗Nedd4-1抗体进行探测。IP重复三次。B类，感染GFP病毒或GFP和HA–Nedd4-1病毒的神经元培养物的代表性图像，表面标记有抗GluA1抗体。对受感染神经元树突中的表面GluA1强度进行定量。n个=50个控制单元，n个=Nedd4-1的65个细胞，超过6个实验。比例尺：全细胞图像，10μm；直枝晶，5μm。C类，mEPSC记录期间表达GFP和Nedd4-1的神经元的代表性图像。D类，例如从GFP感染（对照）或Nedd4-1感染神经元记录的mEPSC痕迹。E类，在所有表达GFP（对照）或Nedd4-1的神经元上平均的事件幅度的量化*第页<0.005，未成对学生t吨测试。F类，GFP（对照）或Nedd4-1神经元事件振幅的累积直方图。G公司量化表达GFP（对照）或Nedd4-1的所有神经元的平均事件频率。n个=21个控制单元，n个=Nedd4-1的19个细胞，超过6个实验。误差条表示SEM。
图5。
图5。
Nedd4-1的过度表达导致表面含GluA1的AMPAR向溶酶体的转运增加。A类在感染GFP（对照）或Nedd4-1病毒之前，在没有或存在leupeptin（leu）的情况下，用抗GluA1抗体对神经细胞培养物进行表面标记。感染18–22小时后感染神经元内化GluA1（红色）的代表性图像，以及与晚期内体/溶酶体抗体Lamp1（绿色）共标记的直树突。比例尺：全细胞图像，10μm；直枝晶，5μm。B类，量化感染神经元树突内吞GluA1的强度。N4-1、Nedd4-1。C类，用Lamp1染色定量感染神经元树突中的内化GluA1强度。n个=在3次实验中，每种条件下30–45个细胞*第页<0.05，Tukey's方差分析事后（post-hoc）测试。误差条表示SEM。
图6。
图6。
Nedd4-1的缺失抑制AMPA介导但非NMDA介导的含GluA1的AMPAR的内吞作用。A类，与T7–Nedd4-1或Nedd4-1resist和pSuper–Scramble或pSuper-Nedd4-1-RNAi共转染的HEK293T细胞裂解物的代表性Western blot。B类，在应用AMPA（100μ米)或NMDA（25μ米). 代表性图像是每次治疗后表达对照或Nedd4-1 RNAi载体（绿色）或与Nedd4-1resist（蓝色）的神经元内化的GluA1（红色）。比例尺，10μm。C类,D类，量化经AMPA处理的对照或RNAi转染神经元的内化GluA1强度(C类)或NMDA(D类).n个在3-4次实验中，每种条件下=30-40个细胞*第页<0.05，Tukey's方差分析事后（post-hoc）测试。误差条表示SEM。
图7。
图7。
含GluA1的AMPAR在老化神经元中的泛素化上调，但被Nedd4-1的缺失所阻断。A类感染表达GFP或GFP的慢病毒和Nedd4-1（N4）RNAi的分离神经元培养物（DIV14或DIV35）5d后，用AMPA（100μ米，10分钟）或在用抗GluA1抗体免疫沉淀产生的裂解物之前不治疗。通过Western blot解析IP，并用抗泛素抗体和抗GluA1抗体进行探测，以确认每个IP中的蛋白质水平相等。裂解物也被分解并用抗Nedd4-1和抗肌动蛋白抗体探测，以证实Nedd4-1特异性敲除。B类，量化每个IP的平均泛素强度。n个=每种情况下4-6个IP*第页<0.05，Tukey's方差分析事后（post-hoc）测试。误差条表示SEM。
图8。
图8。
泛素介导的AMPAR内吞转运模型。1安培，依赖于泛素化的独特内吞/溶酶体分选途径可通过与激动剂AMPA直接激活AMPAR而被刺激，并可能随着神经元成熟而上调。应用AMPA导致钙流入海马神经元，可能激活E3连接酶Nedd4-1泛素化含GluA1的AMPAR。1磅，含GluA1的AMPAR的泛素化介导其运输到溶酶体并最终降解。2年AMPAR在暴露于非泛素依赖的NMDA期间可被招募到单独的内吞/再循环途径。2B型，NMDA的应用使GluA1在丝氨酸845处脱磷酸化并内化。2摄氏度，如果谷氨酸A1被PKA在丝氨酸845处重新磷酸化，它被转运到再循环的内体并返回到质膜（Ehlers，2000）。A、 AMPA；N4-1、Nedd4-1；N、 NMDA；PP、磷酸酶；Ub，泛素。
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