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.2011年2月18日；286(7):5691-707.
doi:10.1074/jbc。M110.162842。 Epub 2010年12月2日。

PC4/Tis7/IFRD1刺激骨骼肌再生，并作为MyoD和NF-kappaB的调节器参与成肌细胞分化

劳拉·米凯利 1, 卢卡·莱昂纳迪, 菲利波·孔蒂, 乔瓦娜·马雷斯卡, 桑德拉·科拉辛加里, 伊丽莎白·马泰, 塞尔吉奥·里拉, 斯特凡诺·法里奥利·维奇奥利, 毛里齐亚·卡鲁索, 费利斯·蒂龙
附属公司

PC4/Tis7/IFRD1刺激骨骼肌再生，并作为MyoD和NF-kappaB的调节器参与成肌细胞分化

劳拉·米凯利等。 生物化学杂志. .

摘要

在骨骼肌细胞中，已知PC4（Tis7/Ifrd1）蛋白通过促进肌细胞增强因子2C（MEF2C）的转录活性发挥MyoD的辅激活剂的作用。在本研究中，我们表明，在成人肌肉中上调PC4可通过增强肌肉发生显著增强损伤诱导的再生。相反，我们观察到成肌细胞中PC4沉默导致延迟退出细胞周期，伴随着延迟分化，并且我们表明这种作用是MyoD依赖性的。我们提供的证据揭示了PC4促前肌力作用的一种新机制，PC4作为NF-κB的负调控因子发挥作用，已知其在转录后抑制MyoD表达。事实上，在诱导MyoD表达的同时，初级成肌细胞中PC4的上调会诱导去乙酰化，从而导致NF-κB p65的失活和核输出。相反，成肌细胞中PC4沉默诱导p65乙酰化和核导入，同时MyoD水平降低。我们还观察到PC4增强了组蛋白脱乙酰化酶介导的NF-κB转录活性的抑制，并且PC4能够与p65和HDAC3形成三分子复合物。这表明PC4通过促进HDAC3向p65的募集来刺激p65的脱乙酰化。总的来说，这些结果表明，PC4通过多种机制控制MyoD通路，在肌肉分化中发挥作用，因此，它积极调节再生肌生成。

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数字

图1。
图1。
条件双转基因小鼠的产生PC4公司骨骼肌中。 A类，转基因CMV-β肌动蛋白-rtTA包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子，其次是强力霉素rtTA和兔β-珠蛋白多聚腺苷化位点。TRE公司-PC4公司转基因包含融合到最小CMV启动子下游的TREPC4公司ORF和SV40晚期聚腺苷化位点。rtTA蛋白结合TRE并激活PC4公司在强力霉素存在下转基因。B类分析骨骼肌中表达的PC4蛋白PC4公司双转基因小鼠，自P30起饮用水中供应的强力霉素激活或未激活。C类Western blot分析PC4蛋白的组织表达。D类,第4页多西环素治疗与否双转基因小鼠G系mRNA的实时PCR检测(多西).PC4公司mRNA折叠表达与未经处理的小鼠的表达水平相关。玻璃钢PC4公司用于实验的小鼠为2个月大的等基因小鼠，是至少6代杂交后代。斯科姆骨骼肌；H（H），心脏；B类、大脑；L（左）、肝脏；K（K）、肾脏；S公司、脾脏；助教，胫骨前；老挝国家电力公司指长伸肌；迪亚，膜片。
图2。
图2。
PC4公司骨骼肌上调表达可增加肌源性基因表达和卫星细胞数量，并促进再生。 A类，归纳MyoD、肌生成素、MEF2C、MHC、Pax7、c-met、巢蛋白、和我的52个月龄Tg TA肌肉中的mRNA水平PC4公司自P30（TG）起转基因激活的小鼠相对于对照小鼠(计算机断层扫描).n个=每组3人。B类，从P60 Tg开始，TA横截面中每面积肌纤维数量减少PC4公司P30后转基因激活小鼠(左边); P45 Tg TA中每面积肌纤维数量的增加PC4公司转基因小鼠受孕后激活(正确的).C类，卫星小区数量的增加，单位为Pax7+P45 Tg TA肌横截面中的细胞/肌纤维第4页转基因小鼠自受孕后激活。实验如所示B类和C类用n个CT组和TG组各3只动物。D类在P30激活转基因的P60 Tg PC4小鼠TA肌中再生肌纤维数量增加，通过中央核的存在进行鉴定。在P60处死小鼠之前的第5、7和20天，通过在TA中注射心脏毒素诱导损伤进行分析。E类，分析再生肌纤维的横截面积D类显示Tg下降PC4公司在损伤后20天组中变得显著的小鼠。n个=3（对于CT和n个病变后5天和7天，TG组为4；n个CT组和TG组在病变后20天均为3。*，第页<0.05，或**，第页<0.01 CT与Tg PC4小鼠组，Student’st吨测试。F类和G公司损伤后5天和7天再生肌纤维的典型共焦显微镜图像。层粘连蛋白免疫荧光染色用于识别每根肌纤维周围的基底层；核由Hoechst 33258可视化。酒吧表示100μm。A–G，CT小鼠是未继承TRE的双转基因小鼠-PC4公司转基因，暴露于强力霉素(多西)作为激活的双转基因小鼠（TG）。
图3。
图3。
shRNA-介导的抑制PC4公司表达损害成肌细胞分化。 A类，PC4和肌球蛋白重链的分析(MHC公司)感染由pSUPER-retro载体产生的逆转录病毒的增殖（GM）或分化（DM）C2C12成肌细胞中的蛋白表达第4页-特定shRNA序列PC4公司/2和PC4公司/7（分别为RS/2和RS/7）或带有无插入逆转录病毒(RS系列). 感染后，用嘌呤霉素筛选细胞96小时，然后在增殖（GM）或分化条件（DM）下培养，如图所示。B类感染逆转录病毒表达的C2C12成肌细胞的Northern分析PC4公司shRNA(RS/2号机组)或使用无插入控制逆转录病毒(RS系列). 总RNA用32P-标记PC4公司或GAPDH公司探针，用于测量mRNA的数量和完整性。C类，C2C12成肌细胞，感染表达逆转录病毒PC4公司shRNA(RS/2号机组)或使用无插入控制逆转录病毒(RS系列)，在DM中培养96h；然后固定细胞并通过次级山羊抗兔FITC-结合抗体用抗MHC抗体进行免疫荧光检测。用Hoechst 33258染料检测细胞核（相应的显微照片正确的).酒吧，140微米。RS/2感染的培养物显示出明显的分化障碍。分化指数（MHC标记的细胞百分比）(D类)和融合指数（MHC标记细胞中检测到的细胞核数量与细胞核总数的百分比）(E类)均显著下降。对于RS或RS/2感染的培养物，分析的成肌细胞数量分别为2067和1920，第页< 0.01; **,第页<0.001，学生t吨测试。
图4。
图4。
剥夺后肌肉特异性蛋白的抑制和细胞周期蛋白的诱导PC4公司在成肌细胞中。 A类，在增殖或分化的C2C12成肌细胞中显示的肌肉和细胞周期蛋白的表达分析第4页显示了代表性的蛋白质印迹（在总共三个实验中）。感染表达逆转录病毒的成肌细胞培养物第4页-用嘌呤霉素筛选靶向RS/2 shRNA或无插入逆转录病毒96小时，然后在GM或DM中培养指定时间。B类，Western blot的密度分析如所示A类; 数值以蛋白质表达的倍数变化表示PC4公司-与RS对照细胞相对的剥夺细胞，在归一化为相应的α-微管蛋白表达值后（对照基线设置为0）。
图5。
图5。
剥夺PC4公司结果肌肉基因mRNA表达受到抑制，细胞周期基因表达增强。对感染表达shRNA的逆转录病毒的C2C12成肌细胞的指示肌肉和细胞周期mRNA进行实时PCR分析PC4公司（RS/2）或对照逆转录病毒(RS系列). 如图所示，细胞在GM或DM中培养。平均±S.E.值来自三个独立的实验，显示为相对于对照样品（GM中的RS-感染细胞）的折叠变化，其设置为单位。TATA-binding protein mRNA被用作正常化的内源性对照。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与控制感染细胞（RS）的相应时间点，学生t吨测试。
图6。
图6。
剥夺C2C12成肌细胞的肌D依赖性细胞周期退出延迟PC4公司. A类流式细胞术分析感染逆转录病毒表达shRNA的C2C12成肌细胞增殖或分化PC4公司(RS/2号机组)或者用对照逆转录病毒(RS系列). 感染细胞用嘌呤霉素筛选96小时，然后在GM或DM中培养指定时间。用碘化丙啶染色后，用流式细胞仪分析DNA含量。五个独立实验的数据显示为PC4公司-G中的沉默细胞0/G公司1、S或G2/M周期阶段，相对于感染对照病毒的细胞百分比。RS/2感染细胞的G1和S种群的增加，在转变为DM后12和48小时。*，第页< 0.05与同一时间点的相应控制组，学生t吨测试。B类和C类，剥夺C3H10T1/2成纤维细胞的流式细胞术分析PC4公司通过异位MyoD诱导或不诱导分化为肌管。C3H10T1/2细胞培养物感染PC4靶向shRNA逆转录病毒(RS/2号机组)或带有对照逆转录病毒(RS系列)用嘌呤霉素筛选96h，然后感染表达MyoD公司（pBABE-MyoD公司) (B类)，或感染了对照逆转录病毒（pBABE）(C类). 如图所示，感染细胞在GM或DM中培养。三个独立实验的数据显示为PC4公司-与对照细胞相比，处于不同细胞周期阶段的沉默细胞。缺少PC4公司导致细胞周期变化，类似于仅在表达C3H10T1/2细胞的C2C12成肌细胞中观察到的细胞周期变化MyoD公司. *,第页< 0.05与同一时间点的相应对照组（RS-invented），Student’st吨测试。
图7。
图7。
在缺乏的情况下，MyoD和MEF2C的转录活性降低PC4公司. A–C，C3H10T1/2细胞培养物被表达shRNA的shRNA逆转录病毒感染PC4公司(RS/2号机组)或对照逆转录病毒(RS系列); 用嘌呤霉素筛选96h后，将细胞接种在35mm培养皿（7×10）中5)第二天与pCDNA3-FLAG联合转染-MyoD公司构建（0.1或0.2μg）或空向量和4RE-LUC报告子（0.1μg）(A类),MCK公司-LUC报告器（0.3μg）(B类)，或3×MEF2-LUC报告子（0.2μg）(C类). 24小时后，将培养物转移到DM中，48小时后收获用于分析。荧光素酶(LUC公司)细胞提取物的活性表示为相对于未转染RS-感染对照样品活性的折叠诱导MyoD公司（设置为单位），这导致与对照RS培养物相比，缺乏PC4的培养物显著减少。酒吧表示在四个独立实验中测定的平均折叠诱导±S.E.，每个实验重复进行。*，第页<0.05或**，第页<0.01（学生的t吨测试）。通过Western blot分析上述处理的平行C3H10T1/2细胞培养物的内源性和外源性MyoD蛋白表达(D类)和MyoD公司实时PCR检测mRNA表达(E类)，表示为相对于未转染MyoD的RS-感染对照样品的平均±S.E.倍表达，设置为单位。TATA结合蛋白mRNA用作正常化的内源性对照。*，第页<0.05（学生的t吨测试）。F类，感染RS/2逆转录病毒靶向的C2C12细胞PC4公司或将对照RS逆转录病毒一式两份接种在35mm培养皿（5×10）中4)第二天用3×MEF2型-LUC报告者（0.1μg），pCDNA1-MEF2C公司（0.025μg）和pSCT-PC4公司（0.5μg）表达载体，如图所示。细胞保存在GM中，转染48小时后收获。荧光素酶活性表示为相对于未转染RS-感染对照样品活性的折叠诱导MEF2C公司或PC4.棒材表示重复进行的三个独立实验的平均折叠诱导±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的t吨测试）。F′Western blot分析平行培养物中MEF2蛋白的表达。G公司感染RS/2或对照RS shRNA逆转录病毒的C3H10T1/2细胞转染3×MEF2型-如图所示，LUC报告者（0.1μg）和pCDNA1-MEF2C表达载体浓度增加。细胞保存在GM中，转染48小时后收获。荧光素酶活性表示为相对于RS-感染对照样品活性的折叠诱导。酒吧表示重复进行的四个独立实验的平均折叠诱导±S.E.。*，第页<0.05（学生的t吨测试）。G′Western blot分析平行培养物中MEF2蛋白的表达。
图8。
图8。
PC4抑制NF-κB转录激活功能。 A类，将C2C12细胞置于两个35mm培养皿（7×10）中4细胞），第二天与核聚变-κB类-LUC报告员（0。1μg）和pSCT-第4页表达结构或空pSCT载体（0.5μg）。细胞在转染24小时后保存在GM中或转换为DM，48小时后收获。如有指示，在收获前6小时加入TNF（10ng/ml）。细胞提取物中的荧光素酶活性表示为相对于GM对照样品活性的折叠诱导（用空载体转染，未用TNF处理）。酒吧表示由五个独立实验测定的平均折叠诱导±S.E.，每个实验重复进行。*，第页<0.05（学生的t吨测试）。B类，C2C12细胞转染为A类Western blot分析PC4蛋白表达。C类，感染表达shRNA的RS/2逆转录病毒的C2C12细胞PC4公司或对照逆转录病毒(RS系列)在两个35mm培养皿（7×10）中培养4第二天转染NF-κB-LUC报告基因（0.1μg）。细胞在转染24小时后保存在GM中或转换为DM，48小时后收获；如有指示，在收获前6小时添加TNF（10 ng/ml）。荧光素酶活性表示为相对于未经TNF治疗的GM RS感染对照样品的活性的折叠诱导。酒吧表示从重复进行的五个独立实验中确定的平均折叠诱导±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的t吨测试）。
图9。
图9。
PC4通过促进p65的HDAC依赖性去乙酰化来抑制NF-κB反式激活功能。 A类和B类PC4与HDAC4或HDAC3协同抑制NF-κB活性。C2C12细胞，在两个35mm培养皿（7×10）中培养4细胞），第二天与核聚变-κB类-LUC报告者（0.1μg），pSCT-PC4公司（0.1–0.3μg）和pcDNA3-myc-HDAC4型（10-30纳克）(A类)或pcDNA3-myc-HDAC3表达结构（10-30 ng）(B类). 必要时包括pSCT和/或pcDNA3空载体，以使DNA含量正常化。细胞保存在GM中，转染48小时后收获。细胞提取物中的荧光素酶活性计算为相对于转染空载体的GM对照样品活性的倍数变化。酒吧表示从重复进行的四个独立实验中确定的平均折叠活动±S.E.。*，第页< 0.05与相应的条件，如所示（学生的t吨测试）。A′和B′，转染的C2C12细胞A类和B类通过Western blot分析PC4、myc-HDAC4或myc-HDAC 3蛋白表达。C类p65的乙酰化和核定位增加第4页对感染RS/2逆转录病毒的C2C12细胞的核提取物进行Western blot分析，将shRNA表达到PC4或对照逆转录病毒(RS系列)在增殖（GM）或分化条件下培养（DM 24或48 h）。用赖氨酸310或MyoD乙酰化的PC4、p65、p65抗体以及核和细胞质定位标记物c-Jun和GAPDH对同一过滤器进行检测。D类从Tg成人肌肉分离的原代成肌细胞中p65乙酰化和核定位减少PC4公司鼠标。细胞核由Tg衍生的原代成肌细胞制备而成PC4公司小鼠，在增殖（GM）或分化条件下培养（DM 12 h）。PC4公司通过给Tg注射强力霉素诱导转基因PC4公司小鼠自受孕后，向原代成肌细胞培养基（20 ng/ml）中添加强力霉素。用赖氨酸310、MyoD、c-Jun或GAPDH乙酰化的PC4、p65、p65抗体检测同一过滤器。E类，PC4与HDAC3和p65形成络合物。用pcDNA转染C2C12细胞（克隆S4组成性过度表达PC4）-Myc-HDAC3或空载体，并在GM或DM中培养48小时，如图所示。用抗p65抗体或对照兔IgG免疫沉淀细胞裂解物，共价结合到琼脂糖珠。免疫复合物(IP：a-p65和控制IP)用Western blotting分析输入细胞裂解物(世界银行)带有抗Myc、抗PC4或抗p65抗体。输入裂解物：用于免疫沉淀的裂解物的1/15。
图10。
图10。
MyoD被招募到PC4公司基因启动子。 A类，MyoD与小鼠结合的ChIP分析PC4公司增殖（GM）或分化（DM）C2C12成肌细胞中的启动子。方案在上面该图显示了小鼠的第一个外显子PC4/第7页所分析的基因和启动子区域位于转录开始前780nt。以下金额PC4公司从抗MyoD抗体获得的免疫沉淀物中检索启动子区域(黑色列)或用正常兔血清(灰色列)表示为输入细胞裂解物中启动子区数量的百分比。用a-MyoD或正常兔血清免疫沉淀ChIPs中的染色质数量相同。B类、MyoD与神经D1C2C12成肌细胞中的启动子作为阴性对照。C类,PC4公司通过实时PCR检测由ChIP分析的成肌细胞重复培养物中的mRNA水平，表示为相对于GM培养物中mRNA数量的倍数值。A–C，平均±S.E.值来自三个实验。
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