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.2010年11月16日；18(5):510-23.
doi:10.1016/j.ccr.2010.10.012。

可逆且无层次组织的患者致瘤黑色素瘤细胞的表型异质性

埃尔萨·金塔纳 1, 马克·沙克尔顿, 汉娜·福斯特, 道格拉斯·R·富伦, 迈克尔·萨贝尔, 蒂莫西·约翰逊, 肖恩·莫里森
附属公司

可逆且无层次组织的患者致瘤黑色素瘤细胞的表型异质性

埃尔萨·金塔纳等。 癌细胞. .

摘要

我们研究了黑色素瘤是否按等级组织成致瘤和非致瘤细胞的表型不同的亚群，或者大多数黑色素瘤细胞是否保留致瘤能力，而不管其表型如何。我们发现，在NOD/SCID IL2Rγ（null）小鼠中，直接从患者身上获得的单个黑色素瘤细胞中有28%形成肿瘤。直接从患者身上获得的所有II、III和IV期黑色素瘤都有共同的致瘤细胞。在连续移植中，所有致瘤细胞似乎都具有无限的致瘤能力。我们无法找到任何缺乏致瘤潜能的大型黑色素瘤细胞亚群。22个异质表达标记，包括CD271和ABCB5，均未富集致瘤细胞。一些黑色素瘤在小鼠中转移，无论它们是来自CD271（-）还是CD271细胞。许多标记物似乎在致瘤性黑色素瘤细胞中可逆表达。

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数字

图1
图1。人类黑色素瘤中生长速度与致瘤细胞频率之间缺乏相关性
（A） 将来自12名转移性疾病患者的单个黑色素瘤细胞皮下注射到NSG小鼠后肿瘤的发展。点表示单个肿瘤，并与肿瘤生长率（左轴）绘制。线代表每个患者所有肿瘤的平均生长率。红星表示每个患者黑色素瘤中形成肿瘤的单个细胞的比例（右轴）。比例尺=1cm。（B） 来自同一12名患者的克隆性肿瘤的平均（±SD）生长率的线性回归分析，与根据经验确定的其母体肿瘤中致瘤细胞的频率进行绘图。第页2数值显示皮尔逊相关系数，表明NSG小鼠肿瘤生长率和NSG小鼠致瘤细胞频率之间没有显著相关性。
图2
图2。人类恶性黑色素瘤细胞在连续移植后表现出无限增殖潜能
（A） 从患者481获得的单个细胞中建立了8个克隆肿瘤。将每种肿瘤的100个等分细胞连续移植到二级和三级NSG小鼠体内。从单个细胞建立后，所有克隆肿瘤均成功传代两次，表明所有致瘤细胞具有无限的致瘤潜力（比例尺=1cm）。（B） 来自其他五名患者黑色素瘤的克隆瘤也进行了类似的传代。每次尝试都成功了。（C-H）患者481（C）、501（D）、526（E）、528（F）、530（G）和534（H）的肿瘤生长率。每组三条横线表示克隆肿瘤（白色）及其后代第一代（灰色）和第二代（黑色）肿瘤的生长速度。在每次传代中，对每个肿瘤细胞系进行2-6次二次或三次注射，几乎所有这些注射都会导致肿瘤。这些肿瘤的生长速度显示为平均值±SD（*，经T检验p<0.05，表明二级和三级肿瘤的生长速率有显著差异）。
图3
图3。抗ABCB5抗体染色在黑色素瘤中是可变的，在NSG小鼠中不能区分致瘤细胞和非致瘤细胞
（A） ABCB5频率+9例黑色素瘤细胞与致瘤细胞频率的关系。AJCC阶段是指美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer）切除黑色素瘤时患者的临床阶段。ABCB5的频率+cells表示流式细胞仪检测到的染色高于同型对照背景的细胞百分比。通过单细胞或限制稀释注射NSG小鼠来确定每个肿瘤中致瘤细胞的频率。用流式细胞术分离ABCB5-（蓝色）和ABCB5+来自患者491（B）和526（C）的（红色）黑色素瘤细胞。百分比表示比同型对照组染色更强烈的细胞的频率（左）。右侧显示了已排序单元格的重新分析。每个图都显示了可行的人类HLA+如前所述，不包括小鼠造血细胞（CD45，TER119）和内皮细胞（CD31）（Quintana等人，2008年）。（D） 将普通ABCB5注射到NSG小鼠后肿瘤形成-和ABCB5+如图3B-C所示，从3名不同患者中分离出细胞（308:n=2个实验，491:n=1526:n=1）。几乎每次注射10个ABCB5-单元格或10 ABCB5+这三个黑色素瘤的细胞形成肿瘤。
图4
图4。CD271的表达与致瘤细胞的频率无关，也不丰富致瘤黑色素瘤细胞
（A） CD271的频率+直接从13例患者和9例异种移植瘤（≤2代）中获得的黑色素瘤细胞与致瘤细胞频率的关系。同时比较NGFR5和C40-1457抗人CD271抗体，得出类似结果（数据未显示）。（B） 对15名患者肿瘤中表达CD271的细胞百分比进行线性回归分析，与同一肿瘤中致瘤细胞的频率进行对比。第页2值（皮尔逊相关系数）表示无相关性。（C） 流式细胞术分离CD271-（蓝色）和CD271+来自患者597、600、608、610、631、641、491、526和534的（红色）黑色素瘤细胞。右侧显示了对已排序单元格的重新分析。每个图都显示了可行的人类HLA+细胞，不包括人类或小鼠造血细胞（CD45+、糖蛋白A或TER119+）和内皮细胞（CD31+）。（D） 向NSG小鼠注射未分化CD271后肿瘤形成-和CD271+如图4C所示，直接从六名患者或三个异种移植瘤（≤2代）中纯化的细胞。两个CD271-和CD271+当从III期或IV期转移性肿瘤（600、608、631和641）中分离出来时，这些细胞很容易以类似的效率形成肿瘤。CD271型-原发性皮肤肿瘤中的细胞致瘤性更强（597，p=0.001；610，p=0.005），尽管CD271致瘤性更低+这些肿瘤中细胞仅占2-12%。另见表S1。
图5
图5。人类黑色素瘤在NSG小鼠中的自发转移，无论其是否来源于CD271-或CD271+黑色素瘤细胞
（A-H）皮下黑色素瘤的自发转移，由注射来自患者481的异种移植物的单个黑色素瘤细胞引起。注射15周后，在注射部位（B-D）观察到一个皮下肿瘤，转移到淋巴结（未显示）、卵巢（E）、胰腺（没有显示）和肝脏（F）。皮下肿瘤（D）、卵巢（G）和肝脏（H）的免疫染色证实存在S100+黑色素瘤细胞（棕色）。（I-Q）CD271移植引起的皮下肿瘤的黑色素瘤转移-或CD271+直接从患者608（I）获得的细胞。移植后23至32周，NSG小鼠的肾脏（J，L，N，P）和肺部（K，M，O，Q）发生转移，无论CD271是否存在-（J-M）或CD271+（N-Q）细胞移植。来源于CD271的肿瘤以类似的效率发生转移-和CD271+单元格（I）。肾（J，P）和肺（K，Q）切片显示浸润的S100+黑色素瘤细胞（棕色）。注射未分离的CD271时也获得了类似的结果-或CD271+来自患者205的异种移植瘤的细胞，不含Matrigel（R）。比例尺=1 cm（C、E、F、L-O）或100μm（D、G、H、J、K、P、Q）。
图6
图6。16个异质表达标记中没有一个能区分致瘤性和非致瘤性黑色素瘤细胞
（A） 通过流式细胞术分析MCAM、CD29、A2B5、CD151、E-钙粘蛋白、CD44、HNK1、CD10、N-钙粘蛋白、CD49d、CD54、L6、c-kit、CD49b、CD9和CD49e的异质性表达。分析来自至少9名不同患者的异种移植瘤中每种标记物的表达（详见表S2）。蓝色和红色门表示标记的选择-/低和标记+/高移植研究用细胞（图6B），基于同型标记（在每个图中用垂直线表示）。（B） 向NSG小鼠注射10个普通、10个标记物后肿瘤形成-/低，或10标记+/高流式细胞术从3至5名不同患者的异种移植瘤中分离出的细胞（CD10和CD49e除外，它们在2名不同患者细胞中进行了测试）。肿瘤很容易从细胞的每一部分形成，因此没有标记物区分致瘤性和非致瘤性黑色素瘤细胞。另请参见图S2和表S2。
图7
图7。黑色素瘤细胞的许多表型上不同的部分可以重现它们来源的肿瘤的异质性
ABCB5（A）、CD166（B）、A2B5（C）、CD151（D）、CD54（E）、CD44（F）、CD9（G）、CD29（H）、N-Cadherin（I）、CD271（J）、CD49e（K-/低和标记+/高分数（分别为右上和右下）。左下角的面板显示了用于生成继发肿瘤的分类细胞组分的重新分析。另请参见图S3。除了CD44、CD49f、E-Cadherin和c-kit外，所有标记物都在2-4个单独的黑色素瘤中进行了检测，这些标记物在一个黑色素瘤内进行了检测。
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