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.2011年1月14日；286(2):1436-44.
doi:10.1074/jbc。M110.145870。 Epub 2010年11月9日。

巨噬细胞中microRNA-155的上调通过增加酒精性肝病mRNA半衰期增加肿瘤坏死因子{alpha}（TNF{alphaneneneep）的生成

沙希·巴拉 1, 米盖尔·马科斯, 凯伦·柯迪斯, Timea Csak公司, 唐娜·卡塔拉诺, Pranti Mandrekar公司, Gyongyi Szabo公司
附属公司

巨噬细胞中microRNA-155的上调通过增加酒精性肝病mRNA半衰期增加肿瘤坏死因子{alpha}（TNF{alphaneneneep）的生成

沙希·巴拉等。 生物化学杂志. .

摘要

肠源性脂多糖（LPS）和Toll-Like Receptors 4（TLR4）-LPS-介导的TNFα生成增加激活枯否细胞（KCs）在酒精性肝病的发病机制中起着重要作用。Micro-RNA（miR）-125b、miR-146a和miR-155可以调节LPS的炎症反应。在此，我们评估了miRs在酒精诱导巨噬细胞活化中的作用。体外慢性酒精治疗导致RAW 264.7巨噬细胞中miR-155而非miR-125b或miR-146a水平随时间增加。此外，酒精预处理增强了LPS诱导的巨噬细胞中miR-155的表达。我们发现酒精诱导的miR-155增加和TNFα诱导之间存在线性相关性。在酒精性肝病小鼠模型中，我们发现与双喂养对照组相比，孤立KC中miR-155水平和TNFα的产生显著增加。miR-155在TNFα调节中的机制性作用分别通过抑制miR-155-后酒精处理巨噬细胞中TNFα水平的降低和miR-155/过度表达后TNFα生成的增加来表明。我们发现，miR-155影响了TNFαmRNA的稳定性，因为miR-155的抑制作用减弱，而miR-155-过度表达增加了TNFβmRNA的半衰期。使用NF-κB抑制剂MG-132或Bay11-7082，我们证明NF-κ子B激活介导KC中酒精上调miR-155。总之，我们的新数据表明，长期饮酒会通过NF-κB增加巨噬细胞中的miR-155，而miR 155的增加有助于通过增加mRNA稳定性来提高酒精诱导的TNFα生成。

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数字

图1。
图1。
LPS和/或酒精治疗后RAW 264.7巨噬细胞miR-155表达增强。 A类，RAW 264.7巨噬细胞被50 m米指定时间点的酒精。B类，RAW 264.7巨噬细胞被50 m米酒精预处理48小时后，加入LPS 6小时，或加入LPS 48小时后6小时。通过qPCR检测miR-125b、miR-146a和miR-155的表达，并将数据归一化为sno202对照。这些miRNAs表达的倍增加与显示非刺激细胞。数据表示平均值（S.E.表示为误差线)至少三个独立实验。显示了统计上的显著差异（*表示第页≤ 0.05与未刺激细胞）。
图2。
图2。
LPS和/或酒精治疗后，RAW 264.7巨噬细胞中TNFα的生成增加，并与miR-155的表达相关。 A类，RAW 264.7巨噬细胞被50 m米用酶联免疫吸附法测定所示时间点的酒精和上清液中的TNFα水平。B类和C，RAW 264.7巨噬细胞被50 m米酒精预处理48小时后，酒精或LPS作用6小时，或与LPS一起作用6小时。用ELISA法测定上清液中的TNFα水平，并在实时PCR中用特异性引物定量TNFαmRNA。数据表示平均值（S.E.表示为误差线)至少三个独立实验。（*表示第页≤ 0.05与未刺激细胞）。显示了统计学上的显著差异。D类RAW 264.7巨噬细胞在不同条件下（50 m）miR-155表达与TNFα生成的相关性米显示了6、24和48小时的酒精和6小时的100 ng/ml LPS（有或没有酒精预处理）(R（右）2= 0.94,第页< 0.01). 通过qPCR检测miR-155的表达，并将数据归一化为sno202对照。收集相同样本中的培养基后，用ELISA法测定上清液中的TNFα水平。每个点表示至少三个独立实验的平均值。
图3。
图3。
慢性酒精摄入会导致小鼠肝脂肪性肝炎，以及酒精、丙氨酸氨基转移酶和内毒素血清水平升高。 A–C，只小鼠（15只/组）按照“实验程序”接受Lieber-DeCarli饮食4周。喂食4周后采集血液，分离血清并分析酒精含量(A类)，丙氨酸氨基转移酶(中高音) (B类)和内毒素水平(C). S.E.的平均值(误差线)显示了(n个= 10). （*表示第页与配对喂养的小鼠相比，<0.05。）欧盟，内毒素单位。D类图中显示了各组福尔马林固定石蜡包埋肝脏的代表性切片，这些肝脏用苏木精和伊红染色。
图4。
图4。
慢性酒精依赖小鼠Kupffer细胞miR-155表达和TNFα增强。 A类和B类，将从配对喂养或酒精喂养小鼠中分离的Kupffer细胞合并(n个=5/组），培养10–12小时，然后用0或100 ng/ml LPS刺激6小时。A类ELISA法测定上清液中TNFα水平。数据表示平均值（S.E.表示为误差线).B类提取总RNA，并在实时PCR中使用特异性引物分析TNFαmRNA水平。看家基因18S的相对TNFαmRNA表达标准化值显示为平均值（S.E.表示为误差线). 显示了统计上的显著差异（*，第页≤ 0.05与双馈控制单元）。C，将从配对喂养或酒精喂养小鼠中分离的Kupffer细胞合并(n个=5/组），培养14小时，收获。提取总RNA，用qPCR检测miR-125b、miR-146a和miR-155的表达。从配对喂养和酒精喂养小鼠分离的Kupffer细胞是否接受治疗在体外用100 ng/ml LPS进一步刺激从酒精喂养小鼠中分离的Kupffer细胞在体外25米米酒精或酒精加LPS 6小时。D类，分离总RNA并分析miR-155的表达。E类用ELISA法分析上清液中的TNFα水平。将数据归一化为sno202对照，并且这些miRs在酒精喂养小鼠Kupffer细胞中的表达增加了倍与图中显示了来自配对喂养小鼠的库普弗细胞。数据表示平均值（S.E.表示为误差线). 显示了统计上的显著差异（*，第页≤ 0.05与配对喂养小鼠的枯否细胞）。纳秒，无统计学意义。
图5。
图5。
miR-155调节TNFα的产生。 A–E，RAW 264.7巨噬细胞转染抗miR-control或抗miR-155(A类和B类)带有预miR-control或预miR-155(C–E类)，暴露于50 m米酒精48小时(A类,B类,D类、和E类)如图所示，用100 ng/ml LPS进一步刺激或不刺激6小时。收集培养基，用ELISA分析上清液中TNFα的产生。TNFα的平均值（S.E.表示为误差线)从三个独立的实验中得出。C，用qPCR检测成熟miR-155的表达，并在转染前miR-对照或前miR-155.后将其归一化为sno202对照。显示了两个实验的数据（平均值±S.E.）。F类用Amaxa转染试剂盒将来自酒精喂养小鼠的Kupffer细胞转染抗miR-control或抗miR-155，转染4-6 h后更换培养基，次日或不使用100 ng/ml LPS刺激6 h，收集培养上清液并通过ELISA分析TNFα的产生。显示了三个独立实验的TNFα平均值。显示了统计上的显著差异（*，第页< 0.05).
图6。
图6。
miR-155通过影响TNFαmRNA的稳定性增加TNFα的分泌。 A–D，RAW 264.7巨噬细胞转染前miR-对照或前miR-155，并用酒精处理或不处理48小时(A类)或转染抗miR-control或抗miR-155，按指示用LPS或酒精加LPS或单独酒精处理(B–D类)，并在5μg/ml放线菌素D存在下进一步培养(A–D). 在所示时间分离总RNA，并在实时PCR中使用特定引物定量TNFαmRNA。使用看家基因18S对数据进行标准化，半衰期表示为不同时间点剩余TNFα的百分比，显示三个实验中有一个具有类似结果，或表示为绝对数（平均值±S.E(误差线))来自三个实验。
图7。
图7。
用NF-κB抑制剂Bay 11-7082或MG-132治疗可防止miR-155对酒精的反应增加。 A类RAW 264.7巨噬细胞经酒精处理48 h，LPS处理或不处理30 min，核蛋白经EMSA处理。B类和C对于NF-κB的抑制，RAW 264.7巨噬细胞用Bay11-7082（0.1μ米)或MG-132（0.25μ米)或DMSO作为阴性对照30分钟，然后暴露或不暴露于酒精（50米米)48小时，并用LPS进一步处理或不处理6小时。用qPCR检测miR-155的表达，并将数据归一化为sno202对照。miR-155表达的-倍增加与显示非刺激细胞。数据表示平均值（S.E.表示为误差线)至少三个独立实验。D类、从配对喂养或酒精喂养动物中分离出的库普弗细胞(n个=8）混合并用100 ng/ml LPS处理或不处理30 min，并对10μg全细胞裂解液进行EMSA以评估NF-κB的活化。E类对于NF-κB抑制，来自配对喂养或酒精喂养动物的Kupffer细胞(n个=10）用MG-132（2.5μ米)或二甲基亚砜30分钟，并用100 ng/ml LPS进一步刺激或不刺激6小时。通过qPCR检测miR-155的表达，将数据归一化为sno202对照，并将饮酒小鼠Kupffer细胞中miR-155的表达增加-倍与图中显示了来自配对喂养小鼠的库普弗细胞。数据表示平均值（S.E.表示为误差线). 显示了统计上的显著差异（*，第页< 0.05).
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