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.2011年3月；39(5):1749-62.
doi:10.1093/nar/gkq935。 Epub 2010年11月4日。

收敛双向转录三核苷酸重复序列R环形成的决定因素

卡拉克·雷迪 1, Mandy Tam女士, 理查德·鲍沃特, 米里亚姆·巴伯, 马修·汤姆林森, 克里·尼科尔·埃德穆拉（Kerrie Nichol Edamura）, 王玉华, 克里斯托弗·皮尔逊
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收敛双向转录三核苷酸重复序列R环形成的决定因素

卡拉克·雷迪等人。 核酸研究. 2011年3月.

摘要

R环已被描述为免疫球蛋白类转换序列、原核和线粒体复制起源以及疾病相关（CAG）n和（GAA）n三核苷酸重复。三核苷酸R环形成的决定因素尚不清楚。三核苷酸重复序列扩增可引起疾病，包括DM1（CTG）n、SCA1（CAG）n，FRAXA（CGG）n和FRDA（GAA）n。这些疾病重复序列可能发生双向收敛转录。我们发现在转录CTG或CGG及其互补链CAG或CCG时形成R环；GAA转录，而不是TTC，产生R环。R-loop的形成对DNA超螺旋、重复长度敏感，对重复中断不敏感，并且是由RNA聚合酶中RNA:DNA杂交延伸形成的。R-环是由一个方向的转录和相反方向的转录产生的，在同一重复序列的同时收敛双向转录过程中形成双R-环结构。由于每个转录的疾病都会重复形成R环，这表明它们可能具有生物功能。

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数字

图1。
图1。
（CGG）39·（CCG）39 FRAXA模板下RNA–DNA杂交形成。当模板DNA用T7 RNA聚合酶转录时，产生异质RNA，产生涂片（转录通道）。单独使用RNase H（与模板DNA配对的RNA碱基特异）处理只会消化与模板DNA成对的RNA。RNase A是单链RNA特有的酶，它可以消化所有游离的单链RNA，留下模板DNA和RNA:DNA杂交结构。注意，RNA–DNA杂交体的迁移速度比超螺旋DNA慢（如图所示，RNA呈淡蓝色）。混合结构因其大小不均匀而产生涂抹。RNA组分越大，DNA的开放程度越大（越放松），因此迁移越接近开放的环状DNA。用RNase H和RNase A处理杂种，去除在转录反应中形成的任何杂种以及生成的转录物，只留下输入模板DNA。当在空的Bluescript载体[pBlueKS（+）]上进行转录，然后单独或联合进行RNase H或RNase A处理时，杂交形成可以忽略不计。
图2。
图2。
RNA–DNA杂交形成在体外含三核苷酸重复序列质粒的转录。(一)体外含有SCA1质粒（CAG）74·（CTG）74和FRAXA质粒（CGG）39·（CCG）39的转录使用T3或T7 RNA聚合酶在任一方向重复。杂交中产生并结合的RNA中包含的重复序列显示在转录模板下方。转录后的样本随后用RNase A或A+H处理，以观察杂种形成。R-环在凝胶上显示为“R”。(B类)与（A）中完全相同的反应和凝胶条件，但转录是在3.5µCi[α-32P] -rCTP。按照“材料和方法”一节的概述，将凝胶干燥并暴露于X射线胶片。
图3。
图3。
EM追踪鉴定扩增DM1（CTG）130·（CAG）130质粒中形成的R环结构在体外RNase A和SSB蛋白的转录和处理。SSB蛋白以R环结构与外环非模板DNA结合。因此，每个R环结构都可视为DNA模板中的一个环，如黑色箭头所示。(一)使用SP6 RNA聚合酶形成R环，产生rCAG:dCTG杂交(B类)使用T7 RNA聚合酶形成R环，产生rCUG:dCAG杂交。
图4。
图4。
增加重复长度时相对RNA-DNA杂交形成的量化。(一)体外在含有（CGG）17·（CCG）17、（CGG（CCG）53，然后用RNase A或A+H处理样品。通过使用图像定量的密度分析，通过测量在开环和超螺旋位置（用“R”表示）之间迁移的产物的比例除以开环下的总产物（包括超螺旋）来量化混合形成。使用RNase A+H处理的样品来确定每个重复长度的超螺旋DNA的位置。图的左侧是用于量化相对杂交形成的代表性凝胶。图中所示的RNA表示RNA:DNA杂交中结合的RNA成分。误差条来自三个单独的实验(N个=3). 使用t吨-比较R-loop形成的测试显示，17和53 rCGG R-loop之间存在显著差异(P（P）=0.0413）以及17和53 rCCG R回路(P（P）=0.0092). (B类)与（A）中的分析相同，但SCA1质粒具有（CAG）30·。使用t吨-比较每个（CAG）·（CTG）重复长度之间R环形成的测试未显示任何统计显著性差异。
图5。
图5。
三核苷酸重复中断对RNA-DNA杂交形成的影响。(一)体外如图所示，用纯（39p）FRAXA质粒（CGG）39·。图中给出了重复轨迹配置，其中空心点是CGG重复单元，填充点是AGG中断。R回路显示为“R”。(B类)体外RNase A或A+H处理后的转录用纯（49p）SCA1质粒（CAG）49·（CTG）49或中断质粒（44i）[（CAG[（CTG）14（ATG）（CTG。
图6。
图6。
RNA的机制：DNA杂交形成在体外转录。(一)R回路形成的两种可能机制示意图。通过线背模型，从RNA聚合酶中排出的新生转录物（以浅蓝色表示）在RNA聚合酶（浅蓝色，椭圆形）的进展后与互补的游离DNA模板链（以红色表示）重新退火。当在RNA酶A（深蓝色）存在下发生转录时，新生转录物在从RNA聚合酶中排出时被降解，因此不能形成杂交。通过扩展的杂交模型，新生转录体仍然与模板DNA结合，并抵制从RNA聚合酶中排出。当在RNase A存在下转录时，由于新生转录物通过与模板DNA结合而受到保护，因此不会降解，因此杂交形成不会被破坏。(B类)FRAXA质粒（CGG）39·（CCG）39在转录反应期间在RNase A缺失（−）或存在（+）的情况下向任一方向转录。对所有转录反应进行进一步的RNase A或A+H处理，以分析杂种形成。(C类)用含有（CAG）74·（CTG）74重复序列的SCA1质粒进行与（B）相同的实验。
图7。
图7。
收敛同时双向或串行转录对R-环形成的影响。(一)体外FRAXA模板（CGG）39·（CCG。R回路显示为“R”。注意，在双向或串行转录的情况下，互补RNA产生，形成凝胶上用“*”表示的dsRNA。这些产物不存在于单向发生的转录反应中。(B类)与（A）中相同，但在体外转录反应在DM1（CAG）79·（CTG）79模板上进行。(C类)DM1（CAG）79·（CTG）79模板收敛转录反应产物的EM分析。同时使用T3和T7 RNA聚合酶启动子对样品进行聚合转录，然后用RNA酶A处理产物，并按照“材料和方法”部分（rCUG和rCAG RNAse A）的描述制备EM。样品还与RNase A一起进行RNase H处理以进行比较（rCUG和rCAG RNase A，H）。在同一模板上以单一方向进行转录，以便进一步比较（rCUG RNase a）。每种类型的转录反应所观察到的产物显示为所分析的分子总数的百分比。每种类型的转录反应至少分析了100个分子。
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