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.2010年10月19日；8（10）：e1000514。
doi:10.1371/journal.pbio.1000514。

静止的成纤维细胞表现出高代谢活性

Johanna M S柠檬 1, 肖江峰, 布莱森·D·贝内特, 亚斯特·莱吉斯·米勒, 伊丽莎白·约翰逊, 艾琳·雷特曼, 伊丽莎白·A·波琳娜, 赫歇尔·A·拉比茨, 约书亚·D·拉比诺维茨, 希拉里·A·科勒
附属公司

静止的成纤维细胞表现出高代谢活性

Johanna M S柠檬等人。 公共科学图书馆生物. .

摘要

哺乳动物中的许多细胞都处于静止状态，其特征是可逆地退出细胞周期。据广泛报道，静止细胞体积缩小、核苷酸合成和代谢活性降低。据报道，与增殖淋巴细胞相比，静止状态下的糖酵解速率要低得多。相反，我们在这里显示，当通过接触抑制被诱导进入静止状态时，初级人类成纤维细胞继续表现出高代谢率。通过监测代谢途径的同位素标记并从数据中定量识别流量，我们表明，接触抑制的成纤维细胞在中心碳代谢的所有分支中利用葡萄糖的速率与增殖细胞的速率相似，从戊糖磷酸途径回流到糖酵解的溢出流量更大。抑制磷酸戊糖途径导致静止成纤维细胞优先凋亡。通过给标记有谷氨酰胺的细胞喂食，我们还检测到从α-酮戊二酸到柠檬酸的三羧酸循环中的“反向”流动，这种流动在接触抑制的成纤维细胞中增强；这种通量可能有助于NADPH从线粒体穿梭到细胞质，以进行氧化还原防御或脂肪酸合成。成纤维细胞的高代谢活性部分用于蛋白质和脂质的分解和再合成，部分用于细胞外基质蛋白的排泄。因此，代谢活动减少并不是静止状态的标志。静止的成纤维细胞解除了与生成子代相关的生物合成需求，将其代谢活动导向自我完整性的保持和对整体有机体有益的替代功能。

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数字

图1
图1。增殖和静止成纤维细胞模型系统。
（A） 增殖（P）、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞用PI染色，并用流式细胞仪分析细胞周期分布。G中细胞的比例0/G公司1静止细胞增多。不同增殖状态的细胞图像如下所示。（B） 收集通过接触抑制或血清饥饿诱导成纤维细胞静止的裂解物，并用p27抗体进行免疫印迹分析基普1第27页基普1在任何一种抗增殖信号使之静止的细胞中都能诱导产生水平。（C） 用派罗宁Y和Hoechst 33342对增殖和静止的成纤维细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析（下面板）。通过多种方法（上图）诱导成纤维细胞进入静止状态时，低派罗宁Y含量的细胞比例增加。
图2
图2。在增殖和静止的成纤维细胞中，糖酵解率相似。
（A） 在增殖（P）、CI7、CI14和CI14SS7细胞的条件培养液中测量葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的量。数据来自三个实验，每个时间点有五个重复，误差条表示标准误差。（B） 从处于不同增殖状态的细胞中提取代谢物，并使用质谱法定量特定代谢物的水平。单个样品中的代谢物水平标准化为收获时的蛋白质含量。显示了四个实验的平均值，每个实验包含4-5个重复。误差条表示标准误差。在错误发现率为0.05的情况下，增殖细胞、CI7细胞和CI14细胞之间的代谢物水平没有差异。（C） 增殖、CI7和CI14成纤维细胞糖酵解的同位素标记动力学。介质已更改为[U-13C] -时间零点时的葡萄糖，以及每种代谢物的分数13在切换到标记培养基后的指定时间测定C-标记。数据来自五个实验，误差条表示标准偏差。3PG，3-磷酸甘油酯；己糖-P，己糖磷酸；戊糖-P，磷酸戊糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸。
图3
图3。增殖成纤维细胞和CI14成纤维细胞中央代谢通量的比较。
通量是通过系统级通量平衡代谢模型中所有可用实验数据的计算集成得出的。箭头大小表示CI14成纤维细胞的流量大小。颜色表示与增殖成纤维细胞相比的相对比率；红色表示CI14成纤维细胞的流量较高，绿色表示增殖成纤维细胞流量较高。虽然核糖磷酸到UTP的通量在增殖过程中（在1000种确定的溶液中）比静止的成纤维细胞更快，但其分布在不同的增殖状态中重叠，因此在这种特殊情况下，不符合我们对不同速率的严格条件（见材料和方法）。αKG，α-酮戊二酸；己糖-P，己糖磷酸；草酰乙酸；戊糖-P，磷酸戊糖；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸盐。
图4
图4。PPP在静止的成纤维细胞中是活跃的。
（A） 增殖（P）、CI7和CI14成纤维细胞PPP中的同位素标记动力学。添加[U后，完全标记的磷酸己糖、磷酸戊糖或七肽庚酮糖-7-磷酸的分数-13C] -在每个时间点绘制每个条件下细胞的葡萄糖。类似地，ATP和UTP与5的分数13绘制了C原子。5×13C-ATP和5×13经串联质谱分析证实，C-UTP在其核糖部分均匀标记，而在基础部分未标记。数据来自五个实验，误差条表示标准偏差-P、 磷酸盐。（B） [1，2乳酸标记示意图-13C] -葡萄糖。[1, 2-13C] -葡萄糖转化为2×13通过典型糖酵解途径和1×13C-乳酸通过PPP。（C） 不同增殖条件下的成纤维细胞与[1,2-13C] -葡萄糖4小时，水平为1×13C-乳酸和2×13用质谱法监测C-乳酸。1×13C-乳酸到2×13在每种情况下，绘制成纤维细胞的C-乳酸曲线。平均值±一个标准误差(n个 = 4） 如图所示。星号表示第页-值<0.01（与CI7相比增殖，第页 = 0.006，与CI14成纤维细胞相比增殖第页 = 0.002（按学生）t吨测试）。
图5
图5。PPP酶被诱导，静止成纤维细胞中GSH的比例增加。
（A） 通过免疫印迹监测增殖（P）和静止成纤维细胞中产生NADPH的G6PD和PGD的蛋白质水平。GAPDH作为负荷控制进行监测。（B） 增殖、CI7、CI14和CI14SS7的总GSH和GSSG含量。数据表示重复进行的一次实验，误差条表示标准偏差。（C） 利用（B）中的数据计算GSH与GSSG的比值。
图6
图6。PPP有助于静止成纤维细胞的存活。
（A） 用DMSO对照、100µM DHEA或250µM DHEA处理增殖（P）或CI14成纤维细胞4 d。用PI培养细胞并用流式细胞仪分析。数据来自四个独立的实验；误差条表示标准误差。对于CI14与未经治疗的增殖，第页 = 0.113. 对于CI14与使用100µM DHEA进行增殖的比较，第页 = 0.0012. 对于CI14与使用250µM DHEA进行增殖的比较，第页 = 0.0011. 星号表示p<0.01的统计显著性。（B） 用乙醇载体对照或不同量的DHEA溶解在乙醇中4 d处理增殖成纤维细胞、接触抑制11 d的成纤维细胞（CI11）或SS7成纤维细胞。通过监测caspase-3/7底物的发光发射来分析细胞的caspase-3/4活性。数据按照车辆控制标准化。对于增殖细胞与CI11细胞，结果是平均四次实验，重复2-3次；误差条表示标准误差，星号表示第页<0.05. 除100µM外，所有剂量的CI11和增殖细胞中正常化caspase-3/7活性在统计学上均存在显著差异。对于增殖细胞与SS7细胞，数据代表三个实验，每个实验有三个重复。SS7和增殖细胞中正常化的caspase活性在所有剂量下都有显著差异。
图7
图7。增殖但非接触抑制的成纤维细胞中的TCA周期被截断。
增殖（P）、CI7和CI14成纤维细胞从未标记转变为[U-13C] -时间零点时的葡萄糖。图中显示了13随着时间的推移，C转化为指定的代谢物。数据表示三个实验的平均值，误差条表示标准偏差。注意增殖细胞中α-酮戊二酸和琥珀酸的最小标记。
图8
图8。谷氨酰胺通过TCA循环驱动顺时针和逆时针流量。
（A） 增殖（P）、CI7或CI14成纤维细胞与[U-13C] -谷氨酰胺。采集代谢物并通过LC-MS/MS测量其标记程度。TCA循环中的α-酮戊二酸可顺时针（或“正向”）方向转化为琥珀酸，或逆时针（或”反向”）方向转换为柠檬酸。唯一已知的5×13C-柠檬酸盐是通过这种来自α-酮戊二酸的“反向”流量。5×13然后可以将C-柠檬酸盐转换为3×13C-苹果酸通过ATP-柠檬酸裂解酶产生乙酰-CoA来驱动脂肪酸的生物合成。数据表示四个实验的平均值。误差线表示标准偏差。（B） IDH1在静止成纤维细胞的转录和蛋白水平上调。通过微阵列（左面板）在增殖、CI7和CI14成纤维细胞的两个独立实验（用下标表示）中监测IDH1的转录水平。数据以热图格式显示，静止细胞中的高表达以红色显示，而静止细胞中表达则以绿色显示。结果显示了多种异柠檬酸脱氢酶同工酶。通过免疫印迹监测IDH1的蛋白质水平（右图），IDH1是一种代谢酶，催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸，从而产生NADPH。GAPDH作为负荷控制进行监测。（C） 增殖、CI7、CI14和CI14SS7成纤维细胞与[U-14C] -谷氨酰胺24小时。提取脂肪酸，以及14C掺入量通过闪烁计数测定，并根据存在的蛋白质量进行标准化。误差条表示标准误差。第页-通过学生的t吨测试，星号表示第页<0.05. 对于CI7与增殖，第页 = 0.0025; CI14与增殖，第页 = 0.018; CI14SS7与增殖，第页 = 0.0001.
图9
图9。切换到[U后，标记的谷氨酸水平随时间降低-13C] -谷氨酰胺存在于CI7和CI14中，但不存在于增殖成纤维细胞中。
增殖（P）、CI7或CI14成纤维细胞从未标记培养基切换到含有[U-13C] -谷氨酰胺，并随时间测定完全标记的谷氨酸（左图）和未标记的谷氨酰胺（右图）的分数。结果是四个实验的平均值，误差条表示标准偏差。
图10
图10。接触抑制的成纤维细胞分泌高水平的特异性细胞外基质蛋白。
从增殖（P）和CI14成纤维细胞中收集条件培养基（4d），这些成纤维细胞不含血清或0.1%的血清，并含有0.03%的血小板衍生生长因子（PDGF-BB）用于增殖细胞。条件培养基的量根据蛋白质含量随时间的变化进行标准化。沉淀条件培养基，并用纤维连接蛋白、胶原蛋白（col21a1）或层粘连蛋白（lama2）抗体进行免疫印迹。
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