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.2010年10月25日；5（10）：e13599。
doi:10.1371/journal.pone.0013599。

versican 3'-非翻译区的表达调节内源性microRNA功能

丹尼尔·Y·李 1, 齐娜·杰亚帕兰, 凌芳, 詹妮弗·杨, 张耀宇（Yaou Zhang）, 阿尔伯特·Y·叶, 李敏慧, 威廉·W·杜, 塔蒂亚娜·沙泽娃, 伯顿·B·杨
附属公司

versican 3'-非翻译区的表达调节内源性microRNA功能

丹尼尔·Y·李等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：成熟microRNAs（miRNAs）是调节转录后基因表达的单链RNA。在我们之前的研究中，我们已经表明，作为非编码转录物片段的云芝3’UTR能够拮抗miR-199a-3p功能，从而调节基质蛋白云芝和纤维连接蛋白的表达，从而增强细胞间粘附和器官粘附。然而，这种非编码片段对肿瘤发生的影响尚待确定。

方法和结果：利用体外和体内实验证实的计算预测，我们报告了versican 3'UTR的表达不仅可以拮抗miR-199a-3p，还可以降低其稳态表达。我们发现，在小鼠乳腺癌细胞系4T1中，versican 3'UTR的表达降低了miR-199a-3p的水平。miRNA活性的降低因此转化为肿瘤生长的差异。计算分析表明，miR-199a-3p和miR-144均以细胞周期调节器Rb1为靶点。此外，miR-144和miR-136也被证明与versican 3'UTR相互作用，被发现靶向PTEN。体外和体内Rb1和PTEN的表达协同上调，表明3'UTR结合并调节miRNA活性，释放Rb1与PTEN mRNA进行翻译。在肿瘤形成分析中，与对照载体转染的细胞相比，转染3'UTR的细胞形成较小的肿瘤。

结论：我们的结果表明，3'UTR片段可用于调节miRNA功能。我们的研究还表明，癌细胞中的miRNAs更容易降解，因为它与非编码3'UTR相互作用。mRNA的这种非编码成分可用于回顾性地调节miRNA的活性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。云芝素3′UTR的表达降低了细胞增殖和肿瘤生长。
（a） 用versican 3′UTR片段（700 bp）或对照载体转染小鼠乳腺癌细胞4T1。获得混合细胞。从混合细胞中分离出RNA，并通过RT-PCR证实3′UTR的表达。（b） 在低血清条件下（1.5%FBS），通过台盼蓝染色后的细胞计数，对转染对照载体或3′UTR的细胞进行细胞增殖分析。*，P<0.05。误差条指示SD（n=5）。（c） FACS细胞周期分析证实，与VerUTR转染细胞相比，载体转染细胞的G2/M细胞数量更多。显示了具有代表性的数据。（n=3）。（d） 将细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。每周记录肿瘤大小，并获得为期四周的肿瘤生长曲线。星号表示重要性。*，P<0.05。误差条表示SEM（n=3）。
图2
图2。versican 3′UTR的表达降低了Ki67，但增强了PTEN的表达。
（a） 肿瘤切片并染色以检测Ki67的表达。载体肿瘤的Ki67染色水平较高（箭头所示）。比例尺，100µm。（b） 肿瘤切片进行PTEN表达染色。PTEN在3′UTR肿瘤中表达增加。比例尺，100µm。（c） PTEN在活细胞（LC）邻近死亡细胞（DC）区域的表达较高，这在云芝3′UTR肿瘤中比在载体肿瘤中更为明显。比例尺，100µm。（d） 对肿瘤裂解物进行western blot分析，并用抗PTEN、抗Rb1和抗肌动蛋白抗体进行检测。与载体对照组相比，3′UTR肿瘤中Rb1和PTEN水平显著升高。
图3
图3。Rb1的表达受miR-199a-3p和miR-144调控。
（a） 用western blot分析3′UTR或载体转染细胞的细胞裂解液中Rb1的表达。VerUTR细胞中Rb1水平升高。（b） 用抗Rb1抗体进行western blot分析VerUTR转基因小鼠和野生型小鼠肺和肾的裂解物。在VerUTR转基因小鼠的器官中检测到Rb1表达增加。（c） 用VerUTR和siRNA联合转染4T1细胞，以对抗3′UTR或对照序列。阴性对照通过与载体质粒和对照序列共同转染细胞进行。从转染细胞制备细胞裂解物，并用抗Rb1和抗肌动蛋白抗体进行western blot分析。与用VerUTR和对照序列共转染的细胞相比，在用VerUTR和siRNA共转染的细胞中观察到表达降低。（d） 将含有miR-199a-3p潜在靶位点的Rb1 3′UTR克隆到荧光素酶载体中，生成构建的luc-Rb1-199a。结合位点突变（红色），产生luc-Rb1-199a-mut。用miR-199a-3p和荧光素酶构建物共同转染U343细胞。荧光素酶活性测定表明，miR-199a-3p抑制荧光素酶活性luc-Rb1-199a。当mi-199a-3p结合位点突变时，这种抑制被废除。**，p<0.0001。误差条，SD（n=3）。（e） 克隆并突变含有miR-144结合位点的Rb1 3′UTR片段（红色），分别产生luc-Rb1-144和luc-Rb1-144-mut。用miR-144和荧光素酶构建物共同转染U343细胞。荧光素酶活性测定表明，miR-144结合位点的突变消除了miR-144，p<0.0001。误差条，SD（n=3）。（f） 携带Rb1 3′UTR的荧光素酶报告载体与VerUTR构建物共转染，以增加U343细胞中与对照载体互补的质粒DNA的数量。VerUTR丰度的增加允许荧光素酶结构的翻译，导致荧光素酶活性的升高。
图4
图4。miR-144和miR-136靶向PTEN。
（a） 用抗PTEN抗体探针对VerUTR和对照细胞制备的细胞裂解物进行western blot分析。在VerUTR细胞中检测到PTEN表达增加，而肌动蛋白染色显示蛋白负载量相等。（b） 通过western blot分析用抗PTEN抗体检测VerUTR转基因小鼠和野生型小鼠肺和肾的裂解物。在VerUTR转基因小鼠的器官中观察到PTEN表达增加。（c） 用VerUTR和siRNAs瞬时转染4T1细胞，以对抗3′UTR或对照序列。作为阴性对照，4T1细胞也转染了对照载体和对照序列。从转染细胞制备裂解物，并用抗PTEN和抗肌动蛋白抗体进行western blot分析。当VerUTR与针对VerUTR的siRNAs联合转染时，PTEN表达降低。（d） 在PTEN的3′UTR中，miR-144的假想靶向位点被克隆并突变（红色），产生两个构建体luc-PTEN-144和luc-PTEN-144-mut。在荧光素酶活性测定中，U343细胞与luc-PTEN-144或luc-PTEN-144-mut与miR-144共转染。突变结构的荧光素酶活性高于表达原始3′UTR的结构，p<0.001。误差条，SD（n=3）。（e） 克隆并突变了PTEN 3′UTR中miR-136的潜在靶向序列（红色），生成了两个结构体luc-PTE-136和luc-PTEN-136-mut。在荧光素酶活性测定中，U343细胞与luc-PTEN-136或luc-PTEN-136-mut与miR-136共转染。当miR-136靶点突变时，对荧光素酶活性的抑制被消除。**，p<0.001。误差条，SD（n=3）。（f） 携带PTEN 3′UTR的荧光素酶报告载体与VerUTR构建物共转染，以增加U343细胞中与对照载体互补的质粒DNA的数量。VerUTR比例的增加结合了更多内源性miRNAs，从而释放了荧光素酶蛋白的翻译，导致了荧光素酶活性水平的提高。
图5
图5。VerUTR的表达影响miRNA水平。
从VerUTR转基因小鼠和野生型小鼠的混合细胞系和初级组织中分离出RNA。通过实时PCR，测定miRNA的相对数量，并与使用miRNA特异性引物进行比较。在这些实验中，对12只4-6个月大的小鼠的初级器官进行了分析。miRNA水平的定量值与U6 RNA水平进行标准化比较。显示了具有代表性的数据。（a） 在肺组织中，VerUTR转基因小鼠的miR-199a-3p水平比野生型小鼠低约39%。相反，转基因肾组织和野生型肾组织之间没有显著差异，p<0.01。误差条，SD（n=3）。（b） 比较原发组织和癌细胞系中miR-199a-3p的水平。与野生型小鼠相比，转基因小鼠肝组织中miR-199a-3p水平降低了29%。在4T1细胞系中，转染VerUTR的细胞与转染对照载体的细胞相比，miR-199a-3p减少了73%，p<0.01。误差条，SD（n=4）。（c） 与野生型小鼠相比，转基因小鼠肺组织中miR-136的水平显著降低了40%。转染VerUTR或对照载体的细胞之间miR-136水平没有显著差异，p<0.05。误差条，SD（n=3）。（d） 检测同一小鼠肺和肾组织中miR-136的表达。*，p<0.05。误差条，SD（n=3）。（e） 分析无关microRNAs miR-17-5p和miR-328的表达，以确保受试者具有可比性，并且其他microRNA的水平不受影响。
图6
图6。miRNA相互作用与3′UTR的关系。
计算分析表明，miR-199a-3p、miR-144和miR-136可能靶向versican 3′UTR。过度表达versican 3′UTR将吸引内源性miR-199a-3p、miR-144和miR-136。因此，versican、Rb1和PTEN的mRNA可以放心地进行翻译。
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