Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull

doi:10.1038/nmeth.1530

.2010年12月；7(12):981-4.

doi:10.1038/nmeth.1530。 Epub 2010年10月21日。

经过抛光和加固的薄颅骨的慢性光学通路

帕特里克·J·德鲁¹, 安迪·Y·施, 乔纳森·德里斯科尔, 根据Magne Knutsen, 巴勃罗百叶窗, 迪米特里奥斯·达瓦洛斯, 卡特琳娜·阿卡索格鲁, Philbert S Tsai先生, 大卫·克莱菲尔德

附属机构

PMID： 20966916
预防性维修识别码：项目经理3204312
内政部： 10.1038/nmeth.1530

经过抛光和加固的薄颅骨的慢性光学通路

帕特里克·J·德鲁等。 Nat方法. 2010年12月.

.2010年12月；7(12):981-4.

doi:10.1038/nmeth.1530。 Epub 2010年10月21日。

作者

帕特里克·J·德鲁¹, 史安迪, 乔纳森·德里斯科尔, 根据Magne Knutsen, 巴勃罗百叶窗, 迪米特里奥斯·达瓦洛斯, 卡特琳娜·阿卡索格鲁, Philbert S Tsai先生, 大卫·克莱菲尔德

附属

¹美国加州大学圣地亚哥分校物理系。

PMID： 20966916
预防性维修识别码：项目经理3204312
内政部： 10.1038/nmeth.1530

摘要

我们提出了一种在小鼠颅骨中形成一个光学窗口的方法，该窗口跨度为毫米，可以稳定数月而不会引起脑炎症。这使我们能够反复成像清醒小鼠皮层毛细血管中的血流，并确定速度的长期相关性。我们还反复成像树突棘、小胶质细胞和血管构筑物，并通过光遗传学使用照明来驱动运动输出，并通过光敏剂诱导微中风。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

**图1。PoRTS窗口程序、光学特性和基本功能**
**（A）**窗口示意图。薄薄的、抛光的颅骨由一块覆盖玻璃保护，玻璃上附着氰基丙烯酸酯水泥。牙科粘接剂用于密封盖玻璃的边缘，并为半月板提供支撑。边缘的减薄区域通常为1–2 mm。**（B）**通过成像0.2μm荧光珠测定TPLSM的点扩散函数，将其嵌入1%（w/v）琼脂糖中，并用40x，0.8 NA水浸物镜成像。轴向深度剖面显示了沿光轴的积分径向强度，即、z轴和径向深度剖面显示了沿径向轴的综合轴向强度。报告的Δz和Δr是包含一半积分强度的全宽。左上角的面板显示了沿着宽度和深度剖面仅通过水成像的珠子。右上方的面板显示了在#0覆盖玻璃下成像的珠子（黑线）以及深度轮廓，以及#1.5覆盖玻璃的轮廓（灰线）。底部的两个面板分别显示了通过切除的PoRTS窗口成像的珠子示例。**（C）**PoRTS窗口植入后第2天（左侧面板）和第30天（右侧面板），thy1-YFP表达神经元的树突和棘。在地表以下30μm处拍摄图像。随着时间的推移，YFP亮度降低，需要对植入后一个月拍摄的图像平均五帧；停留时间为每像素6μs，平均入射功率为35–70 mW。来自两只小鼠的典型图像**（D）**手术后90天，通过PoRTS窗口，最大z轴投影穿过65μm荧光结合的外源性血管系统。每个图像是六帧的平均值，z步长为2μm，驻留时间为每像素3μs，平均功率为25–120 mW。来自35只小鼠的代表性图像**（E）**植入后一个多月，PoRTS窗口下的皮下微血管保持稳定。图像显示了平均5帧、每像素6μs的驻留时间和30–45 mW的平均功率在表面下20–70μm的最大投影。来自两只老鼠的典型图像。

**图2。清醒的头固定小鼠皮层毛细血管中红细胞流速通过PoRTS窗口的长期一致性**
面板A至D中的示例数据是使用10x，0.3 NA镜头从同一只动物身上拍摄，平均超过5-10帧**（A）**顶部面板是在手术后两天，基于相隔10μm的帧，荧光结合的外源性标记血管图像的最大z投影超过90μm。底部面板是手术后51天，同一只动物的一个平面上的图像，但位置不同。彩色线条表示激光焦点的扫描路径：绿色和橙色是沿着毛细血管的匀速段，紫色是毛细血管之间的最短时间段。(B）两条毛细血管中每条毛细血管的一段线扫描数据的时空图，整个300 s运行的计算瞬时速度如下所示。(C）顶部面板显示了面板B中两条速度轨迹的功率谱；0.083 Hz带宽。心跳产生约10 Hz的节律成分。底部面板是作为频率函数的两个毛细血管速度之间的光谱相干程度；0.1 Hz带宽。直线表示p<0.004的显著性，对应于两倍自由度的倒数。注意心率和0.1–1 Hz血管舒缩频率下的强一致性。**（D）**手术后不同时间获得的毛细血管间自发速度相干的示例；0.1 Hz带宽。面板A-D显示了植入后60天内监测的17只动物的代表性数据**（E）**相干性是距离的函数（9只小鼠中有50对血管）。左面板是0.1–1.0 Hz血管舒缩带的平均相干度。中心面板是心脏比率的一致性，它是最大可能一致性的积极控制。右侧面板是2至6Hz频带中的相干性，作为零假设。彩色线对应于对应光谱带的指数函数拟合。

**图3。通过PoRTS窗口诱发的皮层生理学示例**
**（A）**150天前，在触须运动皮层上制作了一个PoRTS窗口，用头戴式ChR2携带清醒小鼠的视频中的样本帧。绿线表示尾须的位置，随着时间的推移而被追踪。**（B）**尾状触须对来自发光二极管（LED）的467 nm光脉冲（5 Hz，100 ms脉冲持续时间；蓝线）作出的尾侧运动。较大的角度表示缩回。来自一组两只动物的A-B代表性数据。**（C和D）**通过200μm深度的最大投影（x-y和y-z）*Cx3cr1型^电子GFP+/*⁻使用孟加拉玫瑰（黄色箭头指向凝块）靶向光学激活阻断单个穿透小动脉100分钟后的小鼠皮层（C组）和100分钟后（D组）。图像是四帧的平均值，每像素驻留时间为3μs，沿z轴步长为1μm。注意，小胶质细胞形态在闭塞的小动脉周围改变为变形虫形状，血流中断，正如底部面板y–z投影中突出显示的穿透血管中缺少Texas Red所证明的那样。窗户植入一天后进行封堵。**（E）**对于与图C和D中相同的动物，在光学产生的中风后两天，可以看到梗死的程度。注意eGFP标记的小胶质细胞侵入囊肿。面板C至E中的数据是一组两只老鼠的代表性图像。

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