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。2010年12月15日；70(24):10351-61.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-0740。 Epub 2010年10月20日。

N-Myc和缺氧诱导因子HIF-1α联合调控神经母细胞瘤的进展

郭良清 1, 尼古拉斯·斯科利, 帕特里克·梅耶斯, 布鲁斯·帕维尔, 丹尼尔·马丁内斯, 约翰·马里斯, M Celeste Simon先生
附属公司

N-Myc和缺氧诱导因子HIF-1α联合调控神经母细胞瘤的进展

郭良清等人。 癌症研究。 。

摘要

在人类神经母细胞瘤中，MYCN基因的扩增预示着预后不良和对治疗的抵抗。由于缺氧主要通过两种结构相关的缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α促进侵袭性肿瘤表型，我们检测了MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞中的缺氧反应。我们在此证明，与未经MYCN扩增的样本相比，HIF-1α（而非HIF-2α）在MYCN-扩增的神经母细胞瘤细胞和原发性肿瘤中优先表达。我们的结果表明，N-Myc和HIF-1α之间的相互作用在神经母细胞瘤中起着关键作用。例如，高水平的N-Myc可以覆盖HIF-1α对细胞周期进程的抑制，使细胞在缺氧条件下继续增殖。此外，HIF-1α和N-Myc通过激活多个糖酵解基因的转录，对神经母细胞瘤的Warburg效应（需氧糖酵解法）至关重要。值得注意的是，在MYCN扩增的神经母细胞瘤中，磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、己糖激酶2（HK2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达均显著高于未扩增的肿瘤。有趣的是，MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞对LDHA酶活性“上瘾”，因为其耗尽会完全抑制体内肿瘤的发生。因此，我们的结果提供了机制性见解，解释了MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞如何应对缺氧应激，以及缺氧如何通过N-Myc和HIF-1α的组合效应促进神经母细胞癌的侵袭性。这些结果还表明，LDHA是神经母细胞瘤治疗的一个新的、药理学上易于控制的靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露

提交人声明没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。MYCN公司扩增的神经母细胞瘤细胞优先表达HIF-1α
（A） 在5%O下不同时间点培养的LAN5和IMR32细胞中HIF-α表达的蛋白质印迹分析2和1.5%O2条件。β-actin作为负荷对照。（B） 在5%O下不同时间点培养的SHSY5Y和SK-N-SH细胞中HIF-α表达的蛋白质印迹分析2和1.5%的O2条件。β-actin作为负荷对照。（C） 缺氧诱导因子-α在不同神经母细胞瘤细胞系中的表达。将SHSY5Y细胞中HIF-1α或HIF-2α的mRNA水平任意设置为1，并计算其余细胞系的相对表达，如图所示。数据以三倍平均数表示，并归一化为β-肌动蛋白mRNA。*p<0.001。（D） 协同调节HIF-2A型通过DNA甲基化和组蛋白去乙酰化表达MYCN公司放大的细胞。用载体或3µM DAC、500 nM TSA以及DAC和TSA组合处理LAN5细胞。CASP8公司和YWHAZ公司分别作为阳性和阴性对照。数据以三份的平均数表示*p<0.01。
图2
图2。MYCN公司扩增的神经母细胞瘤肿瘤优先表达HIF-1α
神经母细胞瘤肿瘤的代表性HIF-α免疫化学染色。肾透明细胞癌作为特异性HIF-α染色的对照。放大倍数：400×。箭头表示细胞核HIF-α染色阳性。
图3
图3。扩散MYCN公司扩增的神经母细胞瘤细胞在缺氧条件下维持
（A） 在21%O下通过连续细胞计数测量的对照组和N-Myc敲低LAN5细胞在七天内的生长2（N） 和1.5%O2（H） ●●●●。（B） 在21%O下生长的LAN5细胞的代表性FACS图2（N） 和1.5%O2（H） 48小时。（C）缺氧48小时后LAN5细胞中BrdU掺入变化总结。结果是3个独立实验的平均值。（D） c-Myc的过度表达挽救了N-Myc击倒LAN5细胞的增殖。插图：a）LAN5细胞；b） N-Myc击倒LAN5细胞；c） N-Myc通过c-Myc过度表达击倒LAN5细胞。
图4
图4。在21%O下生长的LAN5和HCT116细胞中Myc/Max相互作用的变化及其对靶基因表达的后续影响2（N） 和1.5%的O2（H）
将不同时间点的HCT116（A）和LAN5（B）细胞裂解物与Max抗体共沉淀，并对特异性c-Myc、N-Myc和HIF-1α抗体进行免疫印迹。（C） 通过ChIP分析分析Myc（C-Myc或N-Myc）与靶启动子的结合。HCT116和LAN5细胞在21%O下生长2（N） 和1.5%O2（H） 24小时，然后用特异性Myc抗体或同型对照IgG通过ChIP进行分析。图表显示了Myc IP和IgG对照（背景）之间的倍数差异，以及从三次检测中获得的结果*p<0.01。（D） 参与细胞周期进展的Myc靶点的表达。HCT116和LAN5细胞在21%O下生长2（N） 和1.5%O2（H） 24小时，用QRT-PCR分析相关基因表达。结果是三倍的平均值*p<0.01。
图5
图5。N-Myc和HIF-1α有助于MYCN公司扩增的神经母细胞瘤细胞
（A）MYCN公司扩增的神经母细胞瘤细胞表现出Warburg表型。在常氧下培养24小时的LAN5、Kelly、NLF、SK-N-DZ和IMR32细胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量。数据从三倍中取平均值。（B） N-Myc调节参与糖酵解的特定基因的表达。在LAN5细胞中，N-Myc被对照或特异性shRNAs抑制。糖酵解基因的表达通过QRT-PCR测定，显示为平均三倍*p<0.001。（C） HIF-1α调节正常氧下特定糖酵解基因的表达。通过QRT-PCR测定糖酵解基因在对照细胞和HIF-1α敲除细胞中的表达，并显示为平均三倍*p<0.005。（D） 同时抑制HIF-1α和N-Myc对香港2号,PDK1系列和LDHA公司表达式。LAN5细胞中的N-Myc和HIF-1α被对照或特异性shRNAs耗尽。的表达式香港2号,PDK1系列和LDHA公司通过QRT-PCR测定，显示为平均三倍*p<0.01。
图6
图6。LDHA是神经母细胞瘤患者的一个有前途的治疗靶点
（A） LDHA在原发性神经母细胞瘤肿瘤中的相对表达。以胎脑LDHA水平作为对照。肿瘤数量：低危组（28），中危组（21），MYCN公司单拷贝、高风险（32）和MYCN公司放大，高风险（20）。（B） LDHA表达减少会严重抑制MYCN公司扩增的神经母细胞瘤细胞。箭头表示LDHA蛋白*p<0.01。（C） LDHA表达减少抑制Kelly细胞的致瘤能力（每组分析8个肿瘤）。（D） 描述神经母细胞瘤肿瘤进展中N-Myc和HIF-1α协同作用的模型。详见正文。
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