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.2011年1月；39（1）：e5。
doi:10.1093/nar/gkq716。 Epub 2010年10月19日。

MethylViewer:单个模板（MAPit）项目亚硫酸氢盐测序和甲基转移酶可及性协议的计算分析和编辑

卡罗莱纳E帕尔多 1, 伊恩·M·卡尔, 克里斯托弗·霍夫曼, 罗素·P·达斯特, 亚历山大·马卡姆, 大卫·T·邦森, 迈克尔·P·克拉德
附属公司

MethylViewer:单个模板（MAPit）项目亚硫酸氢盐测序和甲基转移酶可及性协议的计算分析和编辑

Carolina E Pardo公司等。 核酸研究. 2011年1月.

摘要

亚硫酸氢盐测序是一种广泛使用的技术，用于检测单链DNA核苷酸分辨率下的胞嘧啶DNA甲基化。用胞嘧啶DNA甲基转移酶进行探测，然后进行亚硫酸氢盐测序（MAPit）是绘制蛋白质-DNA相互作用的有效技术。在这里，我们使用我们先前克隆和表征的GC甲基转移酶M.CviPI的MAPit甲基化足迹来探测HCT116和RKO结直肠癌细胞中的hMLH1染色质。由于M.CviPI阳性样品同时含有CG和GC甲基化，我们开发了一个多功能的可视化程序，称为MethylViewer，用于评估亚硫酸氢盐测序结果。独特的是，MethylViewer可以同时查询亚硫酸氢盐转换序列中多达四个不同的用户定义基序（例如CG、GC等）的胞嘧啶甲基化状态，包括具有简并碱基的基序。数据还可以导出用于统计分析和作为公开质量图像。用MethylViewer对hMLH1 MAPit数据进行分析表明，内源性CG甲基化和可访问的GC位点均以高分辨率定位在单分子上。使用M.CviPII在芽殖酵母中检测到PHO5启动子单分子上定位核小体的破坏，增加了可用于检测蛋白-DNA相互作用的酶的数量。MethylViewer为引物设计和快速、准确和详细分析来自几乎任何生物或生化系统的亚硫酸氢盐测序或MAPit数据集提供了集成解决方案。

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数字

图1。
图1。
MethylViewer初始窗口。加载MethylViewer.exe后的初始窗口(A类)和分析>对齐选项(B类).最小对齐分数激活弹出窗口后，可以将严格程度从15增加到50。同样，用户可以设置基地呼叫中断用于序列记录道中调用基的信号阈值（15到300）和单词大小 … 根据野生型参考序列创建的重叠DNA片段阵列（6至15）的碱基对长度，用于BLAST类局部扩展算法。单击鼠标交互式视图或导入FASTA对齐激活甲基化位点如图3A所示的窗口。
图2。
图2。
FASTA文件格式。野生型序列和感兴趣区域的适当链必须作为第一个条目出现。单个对齐序列的名称可以包含任意数量的字母数字字符；然而，该程序将减少导出图像中标签的字体大小，以适应分配的空间。用户必须确保从文件中删除除>和<之外的所有非字母数字字符。
图3。
图3。
MAPit甲基化足迹分析的默认设置。(A类)甲基化位点通过单击激活的窗口分析>交互式视图或导入FASTA对齐。如果CG和GC的默认设置（参见图4A和10D中的键）是可接受的，那么用户将按照窗口中的提示选择所指示的文件。(B类)自定义甲基化位点通过单击自定义A中的按钮。所示为CG甲基化分析的默认设置：位置1处的甲基化dC残基以黑色表示。请注意包括网站字段表示CG:1。切换到GC:2显示第二个设置，即GC位点位置2处dC残基的甲基化以红色表示。圆形和三角形符号为灰色，因为它们被设置为默认值，分别用于指示导出图像中CG和GC位点的甲基化状态（例如图10）。
图4。
图4。
MethylViewer交互式数据网格。(A类)数据键。(B–E类)交互式网格显示通过分析>交互式视图…>CG和GCHCT116核经0 U M.CviPI（B）、HCT116细胞核+100 U M.CviPI（C）、RKO细胞核+0 U M.CviPI（D）和RKO核+100 U M.CviPI（E）处理。显示的网格是使用默认值生成的基本呼叫中断20和最大对齐单词大小第页，共15页。除第1列外，每列都包含参考序列中特定潜在甲基化位点的数据。除标题行1外，每一行代表四个克隆和测序分子中每一个的未编辑测序调用（C或T）。将光标放在网格中的任何单元格上（标题列1中的单元格除外），会在一个小弹出窗口中显示得分站点的相应序列，如B、D和E所示。查看站点的另一种方法是选择查看>识别甲基化位点，它显示每个甲基化dC位点的颜色，如C所示。此外，单击第1行中的淡蓝色或彩色标题单元格（第一个单元格除外），会显示D所示的有关某个位点的特定信息。最后，左键单击网格中的任何单元格，会显示该得分位点的文件号和序列（C或T）如E.弹出窗口和子菜单所示，只有含有未甲基化残留物的模糊白细胞。
图5。
图5。
数据编辑。(A类)右键单击淡蓝色标题单元格可以查看分子的整个测序轨迹。(B类)在网格中的任何非标题单元格上单击鼠标右键即可显示(C类)引用序列和查询序列之间的局部对齐，以及包含查询站点的序列跟踪。参考序列和查询序列中的甲基化残基在正确对齐的序列中以红色表示。在本例中，上部查询序列中的A残留物（手动用红色圆圈高亮显示；反向序列）为黑色，因为它应该与参考序列中的G对齐。也就是说，对齐中的间隙（在A和B中表示为相应单元内的蓝色示踪线）应放置在紧邻下游的三个C残留物之一处。因此，点击该局部比对窗口白色区域中的任何位置都会显示一个弹出窗口，以纠正核苷酸序列的分配；明确地，G’T’，因为查询分子中对应的核苷酸序列为“A”（正确对齐时）。20的基调用截止值由峰值底部的红色水平线表示。(D类)修正后的G’T’该核苷酸在原始黄色细胞内显示为一个大的白色方形。对测序数据进行了检查和验证，因此测序调用保持不变的单元格用绿色小方框标记。窗口滚动条已在此面板中一直向右移动。(E类)右击D中光标标记的CG细胞，显示查询分子中的A被删除。由于腺嘌呤下游序列中的这个A或任何其他序列可能已被删除，因此残基的核苷酸分配被更改为未对齐。如果使用FASTA文件作为输入，右键单击网格中的任何非标题单元格，将显示引用序列和查询序列之间的整个文本对齐，检查的核苷酸用星号标记。
图6。
图6。
不在查询的甲基化位点中的dC位点的亚硫酸氢盐转化状态。(A类)可视化方式视图>显示dC转换图。将光标放在地图中的任何核苷酸位置上，会在弹出窗口中显示其在碱基对中相对于参考碱基对1的确切位置。序列为C（反向链上的G）且位于查询的甲基化位点之外的残基用一条垂直的蓝线标记。黑色和灰色垂直线表示目标甲基化位点内的残基分别为甲基化和非甲基化。(B类)点击A中所示的任何核苷酸显示其链接的局部测序轨迹和比对。
图7。
图7。
编辑哺乳动物MAPit数据的交互式网格。HCT116+0 U M.CviPI细胞系细胞核(A类)，HCT116+100 U M.CviPI(B类)，RKO+0 U M.CviPI(C类)和RKO+100 U M.CviPI(D类). 使用了图4-6中使用的相同*.ab1文件。单击左上角的淡蓝色单元格（如a和C所示）显示网格中所有分子的未编辑数据的摘要信息。注意，需要调整数字以适应手动更改排序调用的单元格。左键单击除第1行外的每一行的淡蓝色标题单元格，显示与该特定分子相关的信息，如B所示。
图8。
图8。
MethylViewer映射任何输入甲基化特异性。显示的窗口由激活分析>交互式视图…>甲基化位点>自定义以确定图7的MAPit数据中非重叠甲基化的频率。删除了默认的CG:1和GC:2站点；如图所示输入每个字段中的设置，通过单击输入站点NCG:2添加。选中GCG框可从分析中消除重叠站点。任何含有一个或多个脱氧胞苷的序列中，可以指定多达四个位点，包括非顺式位点。
图9。
图9。
图像选项和数据导出。(A类)从显示的下拉菜单中选择了用于生成和标记导出图像的各种功能。在此图像中，默认图像分辨率已从每英寸100点重置为600点（dpi）。(B类)窗口启动者图像选项>选择图像中显示的站点范围。显示的是默认设置，可以更改这些设置，例如，删除未在对齐序列的开头或结尾对齐的站点。(C类)导出数据选项位于显示的下拉菜单中。
图10。
图10。
出版质量，h的缩放图像MLH1型MAPit数据。图7中每个网格的编辑数据都用图像选项如图9所示，通过导出数据>保存按比例绘制的图像，并使用*.svg选项保存。HCT116+0 U M.CviPI细胞系细胞核(A类)，HCT116+100 U M.CviPI(B类)，RKO+0 U M.CviPI(C类)和RKO+100 U M.CviPI(D类). 该图像与MethylViewer制作的图像相同，只是顶部的放大图和底部的图例添加在Adobe Illustrator中，左侧的标签进行了轻微编辑（根据需要增加字体大小以及大小写和斜体）。还插入了红色矩形和蓝色椭圆形，分别描绘了通过外源性添加的M.CviPI染色质探针甲基化的GC位点跨度（根据2:2约定，见正文）和核小体的推断位置。弯曲箭头、TSSa和TSSb；翻译起始密码子。蓝色条表示刻度，表示核小体核心颗粒内147 bp的DNA长度。
图11。
图11。
MethylViewer使用简并DNMT探针分析MAPit数据。(A类)出版物质量，亚硫酸氢转化的缩放*.svg图像电话5从染色质探针M.CviPII未诱导（顶部面板）或雌激素诱导（底部面板）表达的细胞获得的序列。除CCD和m外，颜色与其他图中相同5CCD位置分别由填充的白色三角形和填充的紫色三角形表示。(B类)用于导出A中图像的编辑网格。基本调用截止和单词大小的设置分别为200和15。(C类)每个CCD位点的总甲基化频率如图所示：定位核小体（标记为N−1、N−2和N−3的椭圆；Almer和Hörz，（82）；Pho4结合的上游激活序列【Vogel和Hinnen绘制的标记为UASp1和UASp2的红色填充圆圈（83）】；化合物Mcm1-Fkh位点[如Pondugula中所述，标记为UASm的蓝填充矩形等。(81)]; 和TATA框（白色填充正方形）；主要TSS（弯曲箭头）。根据芽殖酵母中使用的惯例，碱基对坐标是相对于ATG翻译起始密码子的第一个核苷酸指示的。
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