Wild-type and mutant SOD1 share an aberrant conformation and a common pathogenic pathway in ALS

doi:10.1038/nn.2660

.2010年11月；13(11):1396-403.

doi:10.1038/nn.2660。 Epub 2010年10月17日。

野生型和突变型SOD1在ALS中具有异常构象和共同的致病途径

Daryl A Bosco公司¹, 杰拉多·莫菲尼, N穆拉特·卡拉巴达克, 宋玉玉, 弗朗索瓦·格罗斯·路易斯, 皮亚拉·帕西内利, 霍利·古尔斯比, 本杰明·A·方丹, 内森·勒梅, 黛安·麦肯纳-亚塞克, 马修·弗洛什, 杰弗里·N·阿加尔, 珍妮·皮埃尔·朱利安, 斯科特·布莱迪, 小罗伯特·H·布朗

附属公司

PMID： 20953194
预防性维修识别码：第2967729页
内政部： 10.1038/nn.2660

野生型和突变型SOD1在ALS中具有异常构象和共同的致病途径

Daryl A Bosco公司等。自然神经科学. 2010年11月.

.2010年11月；13(11):1396-403.

doi:10.1038/nn.2660。 Epub 2010年10月17日。

作者

Daryl A Bosco公司¹, 杰拉尔多·莫尔菲尼, N穆拉特·卡拉巴达克, 宋玉玉, 弗朗索瓦·格罗斯·路易斯, 皮亚拉·帕西内利, 霍利·古尔斯比, 本杰明·A·方丹, 内森·勒梅, 黛安·麦肯纳-亚塞克, 马修·弗洛什, 杰弗里·N·阿加尔, 让-皮埃尔·朱利安, 斯科特·布莱迪, 小罗伯特·H·布朗

附属

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学中心神经病学系。daryl.bosco@umassmede.du

PMID： 20953194
预防性维修识别码：项目经理2967729
内政部： 10.1038/nn.2660

摘要

许多突变赋予铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）一种或多种毒性功能，这种功能损害运动神经元的活性并导致家族性肌萎缩侧索硬化症（FALS）。使用检测错折SOD1（C4F6）的构象特异性抗体，我们发现氧化野生型SOD1和突变SOD1共享一个构象表位，这在正常野生型SOD中不存在。在一组人类散发性ALS（SALS）病例中，腰骶部脊髓的运动神经元明显呈C4F6免疫反应，表明存在异常野生型SOD1物种。从SALS组织中纯化的重组氧化野生型SOD1和野生型SOD2以类似于FALS连锁突变体SOD1的方式抑制基于运动蛋白的快速轴突转运。我们的研究结果表明，野生型SOD1可在SALS中致病，并确定了FALS和SALS常见的SOD1依赖性致病机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。质谱法证实了接触过氧化氢（H）后WT-SOD1的氧化₂O（运行）₂)**
傅里叶变换质谱（FT-MS）光谱(一)未经处理的WT-SOD1和(b条)氧化WT-SOD1（SOD1ox）。所显示的数据已经被自动去卷积并重建到质量域中。(一)进行FT-MS分析的条件降低了SOD1二聚体界面的完整性和SOD1金属结合能力。因此，WT-SOD1的载脂蛋白形式（15844 Da–平均标称质量）是未改性WT-SOD质谱中的主要物种。(**a-b公司**)峰代表SOD1加合物，其含有钠、钾和磷酸盐离子，来自SOD1纯化过程中使用的缓冲液。(b条)SOD1ox光谱中的优势物种相对于apo-SOD1的质量增加了48 Da（15892 Da），这对应于3个氧（+3ox；+48 Da）的加入。(**c（c）**)SOD1蛋白经过气相分离，然后进行电子捕获解离（ECD，如SOD1ox所示）。MS/MS片段使用具有5 ppm截止值的单同位素质量进行分配，并叠加在SOD1一级序列上（顶部），其中表示包含N末端的未经修饰的c型碎片离子，表示包含C末端的未修饰z型碎片离子，以及表示+48 Da修饰的z型碎片离子，对应于Cys 111处的巯基转化为磺酸（+3ox）。插图显示c的原始数据₇₂⁹⁺碎片。用于推断Cys111氧化位点的EDC产生的SOD1ox肽如补充表1所示。

公式图像 — **图1。质谱法证实了接触过氧化氢（H）后WT-SOD1的氧化₂O（运行）₂)**
傅里叶变换质谱（FT-MS）光谱(一)未经处理的WT-SOD1和(b条)氧化WT-SOD1（SOD1ox）。所显示的数据已经被自动去卷积并重建到质量域中。(一)进行FT-MS分析的条件降低了SOD1二聚体界面的完整性和SOD1金属结合能力。因此，WT-SOD1的载脂蛋白形式（15844 Da–平均标称质量）是未改性WT-SOD质谱中的主要物种。(**a-b公司**)峰代表SOD1加合物，其含有钠、钾和磷酸盐离子，来自SOD1纯化过程中使用的缓冲液。(b条)SOD1ox光谱中的优势物种相对于apo-SOD1的质量增加了48 Da（15892 Da），这对应于3个氧（+3ox；+48 Da）的加入。(**c（c）**)SOD1蛋白经过气相分离，然后进行电子捕获解离（ECD，如SOD1ox所示）。MS/MS片段使用具有5 ppm截止值的单同位素质量进行分配，并叠加在SOD1一级序列上（顶部），其中表示包含N末端的未经修饰的c型碎片离子，表示包含C末端的未修饰z型碎片离子，以及表示+48 Da修饰的z型碎片离子，对应于Cys 111处的巯基转化为磺酸（+3ox）。插图显示c的原始数据₇₂⁹⁺碎片。用于推断Cys111氧化位点的EDC产生的SOD1ox肽如补充表1所示。

**图2。WT-SOD1的结构**
在PyMOL中模拟的WT-SOD1（pdb2C9V）的X射线晶体结构。外显子2内的WT-SOD1残基G93和C111突出显示并标记为紫色。锌原子和铜原子分别以淡青色和橙色显示。SOD1构象特异性抗体表位映射到以下区域：C4F6到外显子4（残基H80-V118以红色突出显示）；A9G3（图4c）至外显子1和2（由β-链1-4组成）；SEDI到β链8；和USOD到β链4。

**图3。C4F6单克隆抗体与SOD1ox和突变SOD1共用的构象表位反应**
(一)使用带有C4F6和SDG6单克隆抗体的天然（非变性）凝胶对重组SOD1ox和WT-SOD1（6μg/lane）进行西方分析。C4F6检测到天然SOD1ox，但未检测到WT-SOD1，而SDG6对这两种蛋白质都有反应。将样品稀释（1 ng/条），并用多克隆抗SOD1抗体（结合位点）进行SDS（变性）Western分析，以证明凝胶负载量相等。(b条)天然西药显示，C4F6仅对天然SOD1 G93A反应，而SDG6仅对来自相应转基因小鼠的裂解物（总蛋白30μg/车道）中的天然WT-SOD1反应。SDS（变性）Western分析（如（a）所示）表明凝胶负载量相等。(**c（c）**)C4F6对重组SOD1 G93A（55纳克/车道）反应，但对SODox（55纳克/车道）不反应，而多克隆抗SOD1抗体（钙生物化学）检测这两种蛋白质。(d日)在变性条件下，C4F6仅对SOD1 G93A反应，而对其他指示的SOD1突变体不反应。(**e（电子）**)C4F6肽段映射到外显子4。用C4F6或多克隆抗SOD1抗体（结合位点）探测转染所示GST标记结构（Δ1-5表示各自的外显子缺失结构，FL=全长）的HEK 293哺乳动物细胞的裂解物（总蛋白30μg）。

**图4。SOD1ox重述了FALS连锁突变体SOD1对顺行FAT的抑制作用**
分离鱿鱼轴浆中的囊泡运动测定。将单个快速轴突运输（FAT）速度（μm/sec）测量值（箭头）绘制为时间（分钟）的函数。深色箭头和线条代表顺行的、传统的运动蛋白依赖性脂肪酸比率。灰色箭头和线条表示逆行的、依赖于动力学的FAT速率。(一)将5μM FALS连锁H46R突变体灌注到鱿鱼轴浆中，可显著降低FAT顺行率(n个=4). (b条)与（a）相比，在鱿鱼轴浆中灌注5μM WT-SOD1对顺行或逆行FAT率没有影响(n个=4). (**c（c）**)灌注5μM SOD1ox模拟SOD1 H46R对顺行FAT的抑制作用(n个=4).

**图5。p38介导SOD1ox诱导的顺行FAT抑制**
(一)使用活化特异性磷酸抗体进行的免疫印迹分析显示，与使用重组未修饰WT-SOD1（WT）灌注的轴浆细胞相比，灌注重组氧化SOD1（SOD1ox）的轴浆中p38（p-p38）显著活化。相反，ERK（pERK）和GSK3（pGSK3）的活性没有发现与特定SOD1物种相关的变化。抗SOD1（D3H5）的单克隆抗体证实了类似水平的SOD1灌注，抗驱动蛋白-1（KHC）的抗体提供了轴浆蛋白总水平的负荷控制。显示了三个独立实验的结果（Squid 1-3）。(b条)定量（a）中的结果显示，与未修饰的WT-SOD1灌注轴浆相比，SOD1ox灌注轴浆中p38激酶的磷酸化（指示p38激活）增加了约4倍(n个=6,*P（P）*通过μ1-μ2的合并t检验，<0.05（*））。误差条反映了多次测量的标准误差。高特异性p38抑制剂SB203580的联合灌注(**c（c）**)和MW01-2-069SRM(d日)阻断了SOD1ox对顺行FAT的抑制作用（与图4c相比）。同样，与FALS相关的突变SOD1多肽通过激活p38激酶的机制抑制顺行FAT（Gerardo Morfini和Scott Brady，提交和10）。

**图6。C4F6单克隆抗体对SALS组织中的WT-SOD1反应**
(**a、 d、e、f**)4例SALS（SALS1-4）显示C4F6阳性染色。SALS1的阳性染色（如面板所示一)当C4F6被排除在染色方案之外时丢失(b条)或当使用替代SOD1-突变特异性A9G3抗体时(**c（c）**). 代表性控制案例(**g-h（克-小时）**)和一个SOD1阴性FALS病例(我)说明在这种情况下缺乏正的C4F6反应性。总的来说，4/9例SALS患者的C4F6染色呈阳性，而0/17例对照患者的C4F染色呈阳性。有关这些病例的临床和人口统计信息，请参阅补充表2和3。

**图7。从SALS组织纯化的WT-SOD1抑制顺行脂肪酸**
从SALS脊髓（SALS hSOD1）和对照（Ctrl-hSOD1。(一)灌注SALS衍生的hSOD1（1μM）选择性抑制顺行FAT（深线，右箭头），而逆行FAT保持不变（灰色线，左箭头）(n个=5个运动图，来自2个独立的hSOD1免疫纯化）。SALS衍生的hSOD1对FAT的抑制作用与FALS-SOD1 H46R和SOD1ox相似（图4）。(b条)灌注控制源性hSOD1对FAT无影响(n个=3个运动图，来自2个独立的免疫纯化）。(**c（c）**)C4F6单克隆抗体（22.5 ng）与SALS衍生的hSOD1共灌注阻断了SOD1对顺行FAT的抑制作用(n个=3轴浆），证明C4F6-反应性SOD1物种介导对FAT的抑制作用。

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中的注释

将SOD1放入折叠中。
Barmada S，Finkbeiner S。 Barmada S等人。自然神经科学。2010年11月；13(11):1303-4. doi:10.1038/nn1110-1303。自然神经科学。2010. PMID：20975748 没有可用的摘要。
运动神经元疾病：错误折叠的野生型SOD1可能与散发性和家族性ALS有关。
耶茨·D·。耶茨·D·。 Nat Rev Neurol公司。2010年12月；6(12):645. doi:10.1038/nrneul.2010.169。 Nat Rev Neurol公司。2010. PMID：21188749 没有可用的摘要。

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