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.2010年10月15日；9(20):4068-76.
doi:10.4161/cc.9.20.13595。 Epub 2010年10月11日。

生或死：p53诱导的凋亡需要DNA结合协同作用

凯萨琳娜·施勒思 1, 乔尔·查尔斯, 安妮·C·布雷茨, 托尔斯滕·施泰韦
附属公司

生死攸关：p53诱导的细胞凋亡需要DNA结合的协同作用

凯萨琳娜·施勒思等。 细胞周期. .

摘要

肿瘤抑制因子p53通过平衡细胞在应激反应中的存活和死亡来提供对癌症的精细保护。持续的压力或不可修复的损伤会触发p53的杀伤功能，永久性地消除作为潜在癌症来源的遗传变异细胞。为了防止干细胞磨损导致不必要的细胞丢失，从而导致过早衰老，p53的杀伤功能受到严格调控，并与促进损伤修复和支持生存的保护功能相平衡，以应对低压力或轻度损伤。在分子水平上，这些基于p53的细胞命运决定涉及蛋白质与辅因子和修饰酶的相互作用，这些辅因子和修正酶调节不同组p53靶基因的激活。此外，我们证明，这种调节部分发生在DNA结合水平。我们发现p53的杀伤功能需要p53四聚体中的四个DNA结合结构域相互作用。这些分子间的相互作用使p53与基因组中不太完美的反应元件协同结合，这些反应元件存在于许多对凋亡至关重要的靶基因中。因此，调节四聚体中的p53相互作用可以提供一种新的有希望的策略来微调基于p53的细胞命运决定。

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数字

图1
图1
DNA结合协同性——基于p53的细胞命运决定中的一个新变量。p53的翻译后修饰：P，磷酸化；乙酰化；me，甲基化；Ubi，泛素化；奈德，奈德化。
图2
图2
人类基因组中p53与DNA结合的协同作用。（A） 本研究中使用的野生型p53和H1螺旋突变体的二聚化模式示意图。小插入物显示了野生型分子中双盐桥的三维结构。为了破坏二聚体内界面，我们在全长p53分子的H1螺旋中引入了适度的电荷中和（E180→L“LR”和R181→L“EL”）和更严重的电荷转换（E180>R“RR”和R81→E“EE”）突变。短名称表示突变蛋白中位置180和181处的氨基酸序列，例如，E180的“ER”，野生型的R181。为了确保功能缺陷确实是由于核心结构域相互作用的缺陷造成的，而不是由核心结构域的结构错误折叠或与其他细胞蛋白的干扰相互作用引起的，我们还将两个最严重的突变E180R和R181E一起引入到单个p53分子中（双突变E180R，R181E“RE”）并在功能拯救研究中使用了两个互补突变体“EE”和“RR”。（B） p53与DNA结合的协同性决定了基因组中结合位点的数量。结合ChIP-ChIP结果和ChIP-qPCR测定的实验验证率，通过生物信息学分析估计结合位点的数量。（C） 验证的普通EL/RE和RE-only结合序列中的从头基序发现。图中显示了二十米和十倍的一致主题，以供比较。（D和E）验证的普通EL/RE和RE-only结合序列中TRANSFAC基序V$P53_01（全位点）、V$P53 _02（半位点）和V$E2F_01（E2F位点作为对照）的频率和平均基序分数。结果显示为由间隔容忍p53MH算法确定的经验证的普通EL/RE和仅RE结合序列中间隔长度的平均±SD（F）分布。
图3
图3
DNA结合协同性对p53序列选择性的影响。（A） 所示为体外翻译野生型p53和所示H1螺旋突变体与dsDNA寡核苷酸（5′-GGG AGC TTA GGC WWG TCT AGG CWW GTC TA-3′）的DNA结合电泳迁移率变化分析（EMSA），WW表示每个半位点中心的AT、AA、TT或TA序列。EMSA的执行如前所述。，与DNA结合协同性降低的H1螺旋突变体（EE、RR、LR、EL）相比，DNA结合协同度增加的突变体（RE和EE+RR）显示出结合低亲和力非CATG序列的能力增加。（B） 与（A）中相同，使用在第21页启动子（5′-TCT GGC CGT CAG GAA CATG TCC（N）1–14增加中心间隔序列（N）的CAA CATG TTG AAG CTC TGG CAT A-3′）1–14高协同性突变体（RE）结合含间隔基序的能力增强，而低协同性突变体（EL）基本上无法结合这些含间隔基元。
图4
图4
DNA结合协同性对反式激活序列选择性的影响。（A） 所示为p53结合序列，与半位点核心CATG（粗体）和间隔区长度（下划线）的一致序列不同。（B） 荧光素酶报告分析。将（A）中序列的单拷贝克隆到pGL4.23[luc2/minP]中，并通过所示的p53合作性突变体进行反式激活测试。将100 ng报告质粒和5 ng p53表达质粒（pCMVneo-BamHI）联合转染到p53-null H1299细胞48小时后，测定萤火虫荧光素酶活性。p53突变体按DNA结合协同性增加的顺序显示。平均值±标准偏差。（C）所示为不同启动子序列p53诱导的最大报告活性。（D） 图中显示了不同启动子序列中由“EE+RR”（高协同性）和“RR”诱导的报告活性的比率。
图5
图5
实验验证的p53靶基因列表中的促凋亡靶基因(补充表1)用间隔物和非CATG核心序列富集p53反应元件。通过皮尔逊卡方检验计算统计显著性。（A） 非促凋亡靶基因中具有中心CATG与CAAG、CTTG或CTAG序列的半位点数量。（B） 在非凋亡靶基因与促凋亡靶基因中存在含有间隔区的反应元件。
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