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.2010年10月13日；30(41):13794-807.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1567-10.2010。

RBPJkappa依赖性信号对成人海马神经干细胞的长期维持至关重要

奥利弗·埃姆 1, 克里斯蒂安·戈里茨, 马塞拉·科维奇, 艾丽斯·施瓦夫纳, 托拜厄斯·施瓦兹, 埃斯拉·卡拉卡, 贝蒂娜·坎普克斯, 伊丽莎白·克雷默, 弗兰克·普弗里格（Frank W Pfrieger）, 路易斯·埃斯皮诺萨, 安娜·比格斯, 克劳迪奥·贾奇诺, 威尔登·泰勒, 乔纳斯·弗里森, D Chichung Lie先生
附属公司

RBPJkappa依赖性信号对成人海马神经干细胞的长期维持至关重要

奥利弗·埃姆等。 神经科学. .

摘要

成年海马齿状回中神经干细胞产生的新神经元有助于学习和情绪调节。为了终生维持海马神经发生，必须严格控制神经干细胞池的维持。我们发现Notch/RBPJκ-信号通路在成年小鼠海马神经干细胞中高度活跃。体内神经干细胞中RBPJκ的条件性失活导致早期成年海马神经干细胞的神经元分化增加，Sox2阳性神经干细胞池耗竭，后期海马神经发生受到抑制。此外，RBPJκ缺陷的神经干细胞在体外表现出自我更新受损和转录因子Sox2表达缺失。有趣的是，我们发现Notch信号增加了成年神经干细胞中Sox2启动子活性和Sox2表达。此外，激活的Notch和RBPJκ在成年海马神经干细胞的Sox2启动子上高度富集，从而确定Sox2是Notch/RBPJκ信号的直接靶点。最后，我们发现Sox2的过度表达可以挽救RBPJκ缺陷神经干细胞的自我更新缺陷。这些结果确定了RBPJκ依赖性通路是成人神经干细胞维持的必要调节器，并表明RBPJ激酶的作用至少部分由Sox2表达的控制介导。

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数字

图1。
图1。
一对成年Tg（Cp-EGFP）25Gaia小鼠的分析表明，齿状回SGZ中Sox2-表达细胞（蓝色）对GFP报告者呈阳性（绿色，箭头）。相反，邻近的神经D表达细胞（红色）GFP报告阴性。GFP表达也存在于齿状颗粒细胞层的分散细胞中。比例尺，10μm。b条对成年Hes5-GFP小鼠的分析显示GFP报告子（绿色）在Sox2阳性（红色）放射状胶质样和非放射状干细胞中的活性。GFAP以蓝色显示。比例尺，20μm。c（c）Hes5-GFP报告子在Sox2阳性细胞（红色，箭头）中活跃，但在NeuroD表达细胞（蓝色）中不活跃。
图2。
图2。
一，研究RBPJκ信号在成年海马干细胞和神经发生中的作用的实验策略。GLAST:：CreERT2；RBPJκ液氧/液氧; R26:：EYFP（RBPJκ-cKO）和GLAST:：CreERT2；RBPJκ液氧/+; 用TAM处理R26:：EYFP（对照）5 d，以诱导RBPJκ和R26:。在最后一次注射TAM后21或60天对动物进行分析。b–d段TAM诱导重组3周后，放射状胶质样干细胞中RBPJκ的缺失会减少干细胞数量。b条RBPJκ-cKO和对照小鼠的典型共焦图像。RBPJκ-cKO中大部分YFP阳性重组细胞（绿色）不表达Sox2（红色）和GFAP（蓝色），也不显示放射状胶质样形态。Sox2染色显示RBPJκ-cKO SGZ中Sox2细胞密度降低。GFAP染色显示齿状回中放射状胶质样干细胞的总体减少。此外，RBPJκ-cKO中YFP阳性细胞总数增加。DAPI以灰色显示。比例尺，20μm。c（c）在RBPJκ-cKO小鼠中，重组细胞中所有Sox2表达细胞、放射状胶质样干细胞（1型细胞，通过Sox2/GFAP表达和放射形态学鉴定）和非放射状干细胞（2型细胞，根据Sox2在SGZ中的表达和定位鉴定）的比例显著降低**第页< 0.01; ***第页< 0.001.d日RBPJκ-cKO小鼠SGZ中Sox2表达细胞、放射状胶质样干细胞（1型细胞）和非放射状干细胞（2型细胞）的密度显著降低*第页< 0.05; **第页< 0.01).
图3。
图3。
重组3周后，放射状胶质样干细胞中RBPJκ的缺失增加了神经发生。一RBPJκ-cKO和对照小鼠的典型共焦图像。在RBPJκ-cKO小鼠中，通过PCNA表达确定的增殖细胞总数（红色）以及YFP阳性重组细胞（绿色，箭头）中PCNA阳性细胞的比例增加。比例尺，20μm。b条，YFP阳性细胞密度的量化*第页< 0.01.c（c）,e（电子），PCNA阳性细胞密度的量化(c（c）) (**第页<0.01）和PCNA阳性细胞比例(e（电子）)在重组细胞中(***第页< 0.001).d日在RBPJκ-cKO小鼠中，表达NeuroD的新生成神经元的总数（红色）以及YFP阳性重组细胞（绿色箭头）中NeuroD-阳性未成熟神经元的比例显著增加。DCX显示为蓝色。比例尺，20μm。（f），神经D阳性细胞密度的量化(***第页< 0.001).克在RBPJκ-cKO小鼠中，通过DCX表达确定的新生成神经元总数（红色）以及YFP阳性重组细胞中DCX阳性未成熟神经元的比例（绿色）显著增加。注意到表达YFP的细胞总数的显著增加。比例尺，20μm。小时、定量DCX阳性未成熟神经元的密度和重组细胞中DCX表达细胞的比例(***第页< 0.001).
图4。
图4。
放射状胶质样干细胞中RBPJκ的缺失增加了YFP阳性和YFP阴性细胞的增殖。增殖性Sox2阳性干细胞（蓝色）存在于YFP阳性（绿色，红色箭头）和YFP阴性（白色箭头）室（左）。同样，在YFP阳性细胞（红色箭头）和YFP阴性细胞（右侧）中发现增殖的DCX阳性未成熟神经元。PCNA显示为红色，DAPI显示为灰色。比例尺，20μm。
图5。
图5。
放射状胶质样干细胞中RBPJκ的缺失会减少海马神经发生，并导致重组2个月后Sox2表达干细胞的持续丢失。一RBPJκ-cKO（右）和对照小鼠（左）的典型共焦图像。在RBPJκ-cKO小鼠中，YFP阳性重组细胞（绿色）不表达Sox2（红色）或GFAP（蓝色）。GFAP染色显示齿状回中放射状胶质样干细胞的数量显著减少。RBPJκ-cKO中绝大多数YFP阳性细胞位于颗粒细胞层。DAPI以灰色显示。比例尺，20μm。b条RBPJκ-cKO小鼠齿状回SGZ中的Sox2表达细胞、放射状胶质样干细胞（1型细胞）和非放射状干细胞（2型细胞）被耗尽(**第页< 0.01).c（c）YFP阳性细胞的表型分析表明，绝大多数重组的放射状胶质样干细胞已离开干细胞室。几乎没有YFP阳性细胞表达DCX，这表明重组细胞在诱导重组2个月后不会促进新神经元的生成。根据以下标准对细胞进行表型分析：1型，Sox2+GFAP+和放射状形态；类型2，Sox2+GFAP−；未成熟神经元，DCX+；成熟神经元，NeuN+。d日RBPJκ-cKO和对照小鼠的典型共焦图像。在RBPJκ-cKO小鼠中，表达DCX的未成熟神经元（红色）几乎不存在。YFP显示为绿色，DAPI显示为蓝色。比例尺，20μm。e（电子），齿状回中表达DCX的未成熟神经元密度严重降低(*第页< 0.05).（f）RBPJκ-cKO和对照小鼠的典型共焦图像。在RBPJκ-cKO小鼠中，PCNA（红色）表达所鉴定的增殖细胞几乎不存在。DAPI显示为蓝色。比例尺，20μm。
图6。
图6。
一、成人RBPJκ神经球的免疫细胞化学分析液氧/液氧用CAG-GFP（对照）或CAG-GFPnlsCRE（CRE-GFP）逆转录病毒（绿色）转导小鼠48小时后。将细胞分离并固定在载玻片上。注意，许多CRE-GFP转导的细胞对Sox2呈阴性（红色，箭头）。b条，定量PCR显示显著降低(第页<0.001）在CAG-GFPnlsCRE（CRE）转导的RBPJκ液氧/液氧神经球。c–f、RBPJκ的神经球分析液氧/液氧用CAG-GFP（对照）、CAG-GFPnlsCRE（CRE）或CAG-GFNlsCRE和CAG-Sox2 IRES dsRED（CRE+Sox2）转导后的神经干细胞。c（c），RBPJκ的神经球形成效率分析液氧/液氧单细胞分析中的NSC(*第页< 0.05; **第页< 0.01).d日、RBPJκ的神经球直径分析液氧/液氧神经干细胞转导后7天(*第页< 0.05).e（电子）、RBPJκ的原发性和继发性神经球形成效率分析液氧/液氧低密度细胞分析中的NSC(*第页< 0.05; **第页< 0.01).（f）左图，接种到微孔中3小时后CAG-GFP转导的单细胞的代表性图像。右，RBPJκ形成的神经球代表性图像液氧/液氧NSC电镀后5天。顶部，明亮的领域；底部，荧光分析。比例尺，100μm。
图7。
图7。
一，5.5 kb小鼠Sox2启动子的电子分析总结。预测的RBPJκ结合位点的位置与转录起始位点相关。b条，报告者使用Sox2-luciferase在HEK293细胞中进行的检测显示，NICD转染后18小时，细胞显著活化(*第页< 0.05; **第页< 0.01).c（c），Reporter使用5.5 kb Sox2-尿苷酶对成年海马神经干细胞进行的分析表明，Sox2启动子被Notch信号激活。RBPJκ的显性负性表达抑制了这种激活(***第页< 0.001).d日用NICD表达载体或GFP编码的对照表达载体转染6 h后，定量RT-PCR分析NSC中Sox2 mRNA的表达(*第页< 0.05).e（电子）对照组NICD或GFP过度表达后成年海马神经干细胞的Western blot分析。通过NICD过度表达增强Notch信号的激活，增加Sox2的表达。负荷控制为α-微管蛋白。（f）EMSA显示成年海马NSC衍生RBPJκ与5.5 kb Sox2启动子序列（预测结合位点#5）结合。克ChIP分析表明Sox2是成年NSC Notch/RBPJκ信号转导的直接靶点。设计PCR引物围绕Sox2启动子上预测的RBPJκ结合位点1（RBPJ kb#1）和5（RBPJ-κ#5）以及控制区（RBPJ-κcon）(*第页< 0.05; ***第页< 0.001). 底部，使用设计用于包围Hes1启动子上RBPJκ结合位点的PCR引物进行的ChIP分析显示，在成年海马NSCs中，Hes1启动子上的Notch1和RBPJκ富集。
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