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.2010年9月28日；107(39):16928-33.
doi:10.1073/pnas.1010317107。 Epub 2010年9月13日。

复制使不适当细胞系中的敲入位点控制区失活

乌苏拉·门泽尔 1, 埃琳妮·克蒂斯塔基, 毛罗·托莱尼, 亨利克·维加-弗南德斯, Dimitris Kioussis公司
附属公司

复制使不适当细胞系中的敲入位点控制区失活

乌苏拉·门泽尔等。 美国国家科学院程序. .

摘要

为了研究基因座控制区（LCR）对一个高度特征化、发育调控的基因座表达的影响，我们将hCD2-LCR作为单一拷贝靶向内源性小鼠CD8基因复合体。生成了两个在mCD8基因复合物中hCD2-LCR整合位点不同的敲除小鼠系，并评估了对CD8辅受体表达的影响。在这些小鼠中，CD4谱系中CD8基因的正常发育沉默被解除，小鼠发育出也表达CD8基因（CD4（+）细胞）。这伴随着CD8基因在远离亚染色体区域的延长环内的物理维持。对这些小鼠的进一步分析揭示了意料之外的流体染色质动力学，其中LCR最初可能主导CD4（+）细胞中存在的内源性CD8基因表达调控过程，但一直受到它们的质疑，导致插入的LCR最终失活，可能是多轮复制的结果。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
CD8/LCR敲除小鼠。靶向CD8基因复合体图，显示hCD2-LCR与CD8α和CD8β基因的整合位点。(A类)敲入线CD8/LCR（cII-III）(B类)敲入序列CD8/LCR（cIII-IV）（条纹盒，hCD2-LCR；填充盒，翻译外显子；开放盒，未翻译外显基因）。DNaseI HS集群的位置用垂直箭头表示。限制性酶位点由垂直条（B，BamHI；C，Cla I；H，Hpa I）表示。水平线表示hCD2-LCR整合位点与CD8基因启动子的相对距离。
图2。
图2。
CD8/LCR敲除小鼠成熟T细胞中CD8共受体的表达。(A类和B类)αβTCR上CD8共受体的表达+通过分别绘制CD4对CD8α或CD8β的图来分析脾细胞。(C类)CD4上CD8α和CD8β共受体的分布+T细胞。(天)CD8中CD8α或CD8β表达水平的平均荧光强度（mfi）+淋巴细胞，以野生型水平的百分比表示。统计分析：未配对学生t吨测试(***P（P）≤ 0.001; **P（P）≤ 0.01). 误差条代表SD。
图3。
图3。
CD8/LCR敲除小鼠T细胞中的DNase I HSs簇II。(A类)外周CD8的DNA酶I分析+，CD4+，或CD4+（CD8+)淋巴细胞。将BamHI消化的DNA与CD8αcDNA探针杂交。母带（8.7 kb和3.1 kb）和cII-1、cII-2和cII-3的带（分别为5.5 kb、3.8 kb和1.8 kb）用箭头表示。(B类)CD8基因复合物簇II的地图。水平条显示CD8αcDNA探针。水平箭头表示DNaseI HSs cII-1、cII-2和cII-3的条带大小。垂直箭头表示DNaseI HS的位置。
图4。
图4。
小鼠CD8/LCR敲除中CD8基因的核定位。(A类)小鼠6号染色体重叠片段库。片段4（粗体）用于研究CD8在细胞核中的重新定位。(B–D类)用于分析的分类T细胞群。显示了事件数（n）和平均距离（以微米为单位）。统计分析（未配对学生t吨测试）CD8基因与其sCT之间的距离(***P（P）≤ 0.001). (B类)野生型CD4中CD8基因信号中心到其sCT中心的距离+和CD8+淋巴细胞(P（P）= 0.00053). (C类)CD4中CD8基因与其sCT的距离+（CD8+)和CD8+来自敲除细胞系CD8/LCR（cII-III）的细胞(P（P）= 0.039). (天)CD4中CD8基因与其sCT的距离+，CD4+（CD8+)和CD8+CD8/LCR（cIII-IV）敲除小鼠的细胞。[CD4+与CD4相比+（CD8+),P（P）= 0.190 × 10−13; CD4细胞+与CD8相比+,P（P）= 0.195 × 10−5].
图5。
图5。
年轻与老年CD8/LCR敲除小鼠中CD8共受体的表达。(A类)CD4中CD8共受体表达的比较+年轻和老年CD8/LCR敲除小鼠之间的细胞。CD4的百分比+CD8（CD8）−外周T细胞中的细胞表达与CD4总量有关+细胞。(B类)CD44中CD8共受体的表达低的和CD44高的亚群体。CD4的百分比+CD8（CD8）−细胞表达与总CD4有关+细胞。(A类和B类)错误栏显示SD。统计分析：未配对学生的t吨测试(***P（P）≤ 0.001).
图6。
图6。
将CD8/LCR敲除淋巴细胞转移到淋巴细胞减少宿主。转移到淋巴细胞减少宿主后，CFSE标记的CD8/LCR（cII-III）淋巴细胞。CD4上CD8共受体的表达+注射用淋巴细胞（输入）。CD4的CFSE谱+移植后7天供体细胞（输出）。CD4中CD8表达谱+根据分割数划分的单元格。百分比与CD4总量有关+细胞。
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