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.2010年11月26日；285(48):37458-66.
doi:10.1074/jbc。M110.163329。 Epub 2010年9月13日。

高尔基钙泵分泌途径钙ATP酶1（SPCA1）是基底样乳腺癌细胞MDA-MB-231胰岛素样生长因子受体（IGF1R）处理的关键调节因子

德斯马·M·格莱斯 1, 伊琳娜·维特, 海伦·M·法迪, 帕拉西克·肯尼, 莎拉·罗伯特·汤姆森, 格雷戈里·蒙泰思
附属公司

高尔基钙泵分泌途径钙ATP酶1（SPCA1）是基底样乳腺癌细胞MDA-MB-231胰岛素样生长因子受体（IGF1R）处理的关键调节因子

德斯马·M·格莱斯等。 生物化学杂志. .

摘要

钙信号是肿瘤进展中重要途径的关键调节器，如增殖和凋亡。大多数评估癌细胞内钙稳态改变的研究都集中在通过细胞质游离钙水平变化介导的改变上。在这里，我们发现基底样乳腺癌的特征是分泌途径钙ATP酶1（SPCA1）的改变，这是一种定位于高尔基体的钙泵。在三维培养中，抑制MDA-MB-231细胞中的SPCA1会导致细胞增殖和形态发生显著变化，而不会改变内质网应激诱导的敏感性或整体钙信号的变化。相反，抑制MDA-MB-231细胞中SPCA1的作用在于改变分泌途径中钙依赖酶的调节，例如前蛋白转化酶。抑制SPCA1可显著改变胰岛素样生长因子受体（IGF1R）的处理过程，功能性IGF1Rβ水平显著降低，非活性反式高尔基网络pro-IGF1R形式积聚。这些研究首次确定了与基底样乳腺癌亚型相关的钙转运蛋白。SPCA1抑制对MDA-MB-231细胞IGF1R处理的显著影响不依赖于整体钙信号的改变，也表明一些钙转运蛋白可以调节对肿瘤进展重要的蛋白质的处理，而不会引起胞浆钙信号的重大改变。SPCA1抑制剂可能提供一种替代策略，以直接抑制IGF1R，并减弱对基底部乳腺癌重要的其他前蛋白转化酶底物的处理。

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数字

图1。
图1。
SPCA1在乳腺癌临床样本和细胞系中的表达。 A类，相对表达式（log2)在包含295例原发性乳腺肿瘤微阵列图谱的数据集中评估SPCA1的表达（33）。基因表达谱用于将乳腺肿瘤分为五种指定的分子亚型。水平线表示中值。使用Kruskall-Wallis检验测量显著性，**表示第页<0.01和***表示第页< 0.001.B类，相对SPCA1表达式（log2)在分类为基底样乳腺癌细胞系的微阵列数据集中进行评估(n个=28）或灯具(n个= 26).水平线表示中值。使用曼希特尼检验（Mann-Whitney Test）测量显著性，其中*表示第页< 0.01.C类，使用Oncomine分析和可视化SPCA1的表达TM（TM）（《生物科学纲要》，密歇根州安阿伯）。在每项独立研究中，根据Elston-Ellis分级方法分级的更高级别肿瘤中观察到SPCA1表达增加。Ivshiria等级1对3,第页< 4.1 × 10–9; 米勒等级1对3,第页< 8.6 × 10–9; 和Sotiriou等级1对3,第页< 1.5 × 10–6.n个研究值如下：1级(n个=68），2级(n个=126）和3级(n个= 55); 米勒1级(n个=67），2级(n个=128）和3级(n个= 54).
图2。
图2。
MDA-MB-231细胞中SPCA1的siRNA沉默。 A类，SPCA1 siRNA治疗后SPCA1 mRNA的定量。使用双向方差分析进行统计分析；*，第页与各时间点的siNT相比<0.05。B类，检测SPCA1 siRNA处理后的SPCA1蛋白。免疫印迹图像是三个独立实验的代表性印迹。从汇集的数据中获得密度测量数据。将数据归一化为β-actin，并将其与siNT相关，作为平均值±S.E。使用单向方差分析进行统计分析；*，第页与siNT相比<0.05。C类检测SPCA1 siRNA处理后的PMCA和SERCA2蛋白。
图3。
图3。
SPCA1 siRNA沉默对二维和三维培养中细胞生长和形态的影响。 A类，MDA-MB-231细胞经SPCA1 siRNA处理后在二维培养中的活细胞数。数据来自三个独立实验，平均值±标准偏差n个=11或12。使用单向方差分析进行统计分析；*，第页与96小时时的siNT相比，<0.05。B类MDA-MB-231细胞在三维培养中生长时，SPCA1 mRNA在SPCA1 siRNA存在下的定量（在细胞培养方法的顶部）。结果为平均值±S.E(n个= 3); *,第页使用单向方差分析，与siNT相比<0.0001。C类，MDA-MB-231细胞转染后96 h三维培养的活细胞数。数据来自三个独立实验，平均值±标准偏差n个= 9–12.天，MDA-MB-231细胞在细胞培养物上三维生长的形态学。细胞用Alexa Fluor®488和DAPI核染色法染色。所示图像代表了每个治疗组三个孔的三到四个随机视野，在三个独立实验中重复。图像线以上显示卵磷脂和DAPI染色(比例尺，25μm）。图像线以下仅显示阴茎倍体蛋白染色(比例尺，12.5μm）。
图4。
图4。
A类在SPCA1 siRNA、非靶向siRNA或转染剂存在下，衣霉素治疗MDA-MB-231细胞。将数据标准化为不含衣霉素，并描述为平均值±S.E(n个=12）来自三个独立实验。B类，使用实时RT-PCR定量内质应激标记物GRP94 mRNA。在不含衣霉素的情况下，将数据归一化为相对于siNT的18 S rRNA，这是三个独立实验的代表。平均值±S.E(n个= 3).C类，SPCA1 siRNA对内质网CPA介导的钙瞬变的影响。痕迹显示来自三个独立实验的12个单井的平均荧光；虚线代表平均值±S.E。底部记录道不代表CPA控制，以及上部水平线表示BAPTA或CPA治疗的期间。个别实验被归一化为siNT。天，CPA诱导钙瞬变14.3至497.58 s的曲线下面积。数据表示平均值±s.E.，使用单向方差分析进行统计分析，*表示第页与siNT相比<0.05。
图5。
图5。
SPCA1 siRNA对PAR和嘌呤能受体激动剂介导的胞浆钙信号传导和IGF1R蛋白水解过程的影响。 A类，嘌呤能受体激动剂ATP介导的胞浆钙信号传导。B类，PAR1受体激动剂凝血酶（3.0单位/ml）介导的胞浆钙信号；C类，PAR2受体激动剂胰蛋白酶（100 n米)-介导的胞浆钙信号传导。对于每种激动剂，从三个独立实验的11到12个单孔显示平均荧光±S.E；虚线代表S.E.，以及底部痕迹不代表激动剂对照；上部水平线表示BAPTA或激动剂治疗期间。从14.3到200.15秒的ATP、胰蛋白酶和凝血酶诱导的钙瞬变测量曲线下的面积。个别实验归一化为siNT。使用单向方差分析进行统计分析，*表示第页与siNT相比<0.05。
图6。
图6。
TGN-pro-IGF1R蛋白水解过程的免疫印迹分析。 A类，三个独立实验的代表性免疫印迹。B类，对合并数据进行IGF1Rβ密度分析，三个单独的实验归一化为β-actin，并与各自的siNT对照相关。使用单向方差分析进行统计分析；*表示第页与siNT相比<0.05。C类在MDA-MB-231细胞中没有SPCA1的情况下，IGF1R探针免疫印迹的代表性品系分析。
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